第六讲RNA的生物合成与转录后加工.

第六讲RNA的生物合成与转录后加工执行生命功能、表现生命特征的主要物质是蛋白质分子。DNA贮存着决定生物特征的遗传信息，只有通过蛋白质才能表达出它的生命意义，直接决定蛋白质合成及蛋白质特征的不是RNA而是DNA，因而人们确定DNA是遗传信息贮存者后就推测DNA是通过RNA去决定蛋白质合成的。50年代末RNA聚合酶的发现开始证实了这一推测。以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息即DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始（图6-1）。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体，它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。图6-1DNA转录的基本过程主要内容♣RNA合成的酶学基础♣RNA合成的基本过程♣RNA转录后的加工与修饰真核和原核细胞内都存在有DDRP，迄今发现的DDRP的有以下特点：①以DNA为模板:在DNA的两条多苷酸链中只有其中一条链作为模板，这条链叫做模板链，又叫反义链。DNA双链中另一条不做为模板的链叫做编码链，又叫有意义链，编码链的的序列与转录本RNA的序列相同，只是在编码链上的T在转录本RNA为U，由于RNA的转录合成是以DNA的一条链为模板而进行的，所以这种转录方式又叫做不对称转录。1、RNA合成的酶学基础5´……GCAGTACATGTC……3´3´……cgtcatgtacag……5´5´……GCAGUACAUGUC……3´N……Ala·Val·His·Val……CDNA转录mRNA翻译肽DNA模板、转录产物mRNA和氨基酸序列之间的关系编码链模板链｝5335模板链编码链编码链模板链结构基因转录方向转录方向②都以四种三磷酸核苷酸的底物为原料；③都遵循DNA与RNA之间的碱基配对原则，A=U，T=A，C=G，合成与模板DNA序列互补的RNA链；④RNA链的延长方向是5’→3’的连续合成；⑤需要Mg2+或Mn2+离子；⑥并不需要引物。RNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶活性，所以没有校正功能。（1）RNA聚合酶所催化的反应（2）大肠杆菌RNA聚合酶表6-1大肠杆菌RNA聚合酶亚单位分子量亚单位数目功能α365122决定哪此基因被转录β1506181与转录全过程有关β’1556131结合DNA模板702631辨认起始点核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)RNA聚合酶RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合亚基组成：2'w=2'w+全酶核心酶RNA聚合酶的组成亚基——解开前方的DNA双螺旋、恢复后面的DNA双螺旋亚基——催化磷酸二酯键的形成'亚基——与DNA的非模板链结合核心酶：解开前方的DNA双螺旋、RNA链的延伸、恢复后面的DNA双螺旋亚基：识别DNA上转录的起始部位，从而引导全酶结合上去此外，每个RNA聚合酶还含有2个Zn离子。（3）真核生物RNA聚合酶表6-2真核生物的RNA聚合酶种类分布合成的RNA类型对α-鹅膏蕈碱的敏感性Ⅰ核仁rRNA不敏感Ⅱ核质hnRNA低浓度敏感Ⅲ核质tRNA，5SRNA高浓度敏感Mt线粒体线粒体RNAs不敏感真核生物RNA聚合酶的共同特征3种聚合酶都由2个大亚基，12个以上的小亚基组成；在3种聚合酶之间，最大2个亚基，至少5个小亚基的基因编码区具有同源性；4-7种小亚基为各种RNA聚合酶特有；都具有原核RNA聚合酶核心2’同源的亚基；最大亚基与’相似，次最大亚基与相似；RNA聚合酶的羧基末端结构域（CTD）RNA聚合酶II最大亚基的羧基端,存在着一种6个氨基酸的重复序列:Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser,在哺乳类中重复52次，在酵母中重复26次，称为CTD。转录起始时：Ser、Thr的羟基非磷酸化，易与DNA结合；转录延伸时，磷酸化，松弛与DNA的结合。2、转录的基本过程（图6-2）（1）RNA合成的识别（2）RNA合成的起始与延伸过程（3）RNA合成的终止阶段图6-2转录的主要过程原核生物：Pribnow框和Sextama框（图6-3）真核生物：TATA框和CAAT框（图6-4）（1）转录的识别–启动子图6-3原核生物启动子的结构示意图转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5'末端的序列称为上游(upstream)，而把其后面即3’末端的序列称为下游(downstream)。在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3……，上游方向依次为-1、-2、-3……。Pribnow框：－10区，保守序列为TATAAT。Pribnow框是RNA聚合酶的牢固结合位点，简称结合位点。细菌中常见两种启动子突变：启动子上升突变，提高转录活性；启动子下降突变，降低转录水平。σ的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。Sextama框：－35区，保守序列为TTGACA。Sextama框是RNA聚合酶中σ的识别位点，也是RNA聚合酶的初始结合位点。Pribnow框与Sextama框之间的碱基序列并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；天然启动子这段距离多为15～20bp，距离的大小可能是决定启动子强度的因素之一。实验表明：两个序列之间的距离为17bp时，转录效率最高。图6-4真核生物的启动子序列（2）转录的起始转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。4.－10区DNA双链解开12～17bp，形成开放的二元启动子复合物（模板－酶）。2.RNA聚合酶全酶(2)与模板－35序列结合，形成闭合的二元闭合启动子复合物。转录起始过程1.因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列）3.RNA聚合酶向－10区转移，并与之牢固结合。RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3转录起始复合物:5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi5.在RNA聚合酶β亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板－酶－RNA）。6.当三元复合物中RNA长6～9个核苷酸时，因子从全酶解离下来，进入延长阶段。RNA聚合酶有两个核苷酸结合位点：一个是起始核苷酸位点；一个是延长核苷酸位点。一般只有嘌呤核苷酸填充了起始位点，才能形成第一个磷酸二酯键。RNA合成的第一个核苷酸总有GTP或ATP，以GTP常见，此时因子从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的因子与另一个核心酶结合成全酶反复利用。真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，已经知道，在所有的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子，它们与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。真核生物基因中，有专门为蛋白质编码的基因，这些基因由RNA聚合酶Ⅱ负责进行转录起始关键性作用。根据这些转录因子的作用特点可大致分为以下二类：第一类为普遍转录因子：它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置上开始。普遍转录因子是由多种蛋白质分子组成的，其中包括特异结合在TATA盒上的蛋白质，叫做TATA盒结合蛋白，还有形成一组复合物叫做转录因子ⅡD。TFⅡD再与RNA聚合酶Ⅱ结合完成转录起始复合物的形成（图6-5）。图6-5转录起始复合物的模式图第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子或者叫可诱导性转录因子：这类TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时才需要的一类转录因子。RNA链的延长靠核心酶的催化，在起始复合物上第一个GTP的核糖3’-OH上与DNA模板能配对的第二个三磷酸核苷酸起反应形成磷酸二酯键。聚合进去的核苷酸又有核糖3’-OH游离，这样就可按模板DNA的指引，一个接一个地延长下去。因此RNA链的合成方向也是5’-3’。由于DNA链与合成的RNA链具有反平行关系，所以RNA聚合酶是沿着DNA链3’-5’方向移动。（3）转录的延伸整个转录过程是由同一个RNA聚合酶来完成的一个连续不断的反应，转录本RNA生成后，暂时与DNA模板链形成DNA·RNA杂交体，长度约为12个碱基对，形成一个转录泡（图6-6）。转录速度大约是每秒钟30-50个核苷酸，但并不是以恒定速度进行的。图6-6转录的延伸过程1.亚基脱落，RNA聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。3.碱基配对原则：A-U，T-A，G-C4.延长中的转录复合物也叫转录泡。随着RNA聚合酶前移，转录产物RNA不断移出转录泡，已转录完毕的DNA双链又重新复合而不再打开。5.原核生物的转录和翻译偶联进行。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi原核生物RNA转录的延长过程图6-7原核生物转录过程中的羽毛状现象53DNA核糖体RNARNA聚合酶•依赖ρ因子的转录终止•非依赖ρ因子的转录终止（4）转录的终止和新生RNA链的释放指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。分类依赖ρ因子的转录终止（图6-8）1969年，Roberts发现了能控制转录终止的蛋白质，即ρ因子。它由相同的6个亚基组成六聚体，分子量200kD。ρ因子具有NTP酶活性和解螺旋酶活性，是促使转录三元复合物解离的根本原因。ρ因子的NTP酶活性依赖于单链RNA的结构。ρ因子依赖性终止子含有一个反向重复序列，使RNA末端形成一个发夹结构，导致转录延宕，ρ因子得以发挥作用，终止转录。图6-8非依赖ρ因子的转录终止（图6-9）DNA模板接近转录终止的区域内，有较密集的A-T配对区或G-C配对区，且G-C配对为回文结构。转录产物RNA的3´-末端有若干个连续的U。连续U区的5´-端前方碱基形成茎环结构或发夹结构。这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。转录方向3´3´5´TCGGGCGAGCCCGCCGCCCGAGCGGGCTAAAAAATTTTTT3´3´5´5´DNA模板链编码链AAAAAAUUUUUU5´CGCCCGAGCGGGCU5´TTTTTTDNA模板链编码链转录产物3´图6-9不依赖ρ因子的转录终止茎环结构使转录终止的机理•使RNA聚合酶变构，转录停顿；•密集A-U配对使转录复合物趋于解离，释放RNA。5´pppG5335RNA-pol原核生物与真核生物转录的区别原核生物真核生物RNApol一种高度分工起始转录因子没有需要（各不同）延长核小体影响没有有启动子以外序列没有有且复杂转录产物多顺反子单顺反子场所转录与翻译偶联不偶联转录终止两种终止子不明确转录与复制的相似之处：⑴都是酶促的核苷酸聚合过程；⑵都以DNA为模板；⑶都需依赖DNA的聚合酶；⑷聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键；⑸都从5′至3′方向延伸成新链多聚核苷酸；⑹都遵从碱基配对规律——但转录忠实性要低于DNA复制。⑺转录与复制都受到严格的调控转录与复制的异同点转录和复制的区别引物有无高度进行性中途不停止可一段一段进行A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA（半保留复制）产物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录（不对称转录）两股链均复制模板转录复制A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA（半保留复制）产物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录（不对称转录）两股链均复制模板转录复制3、转录后加工过程及其机制mRNA的前体加工rRNA的前体加工tRNA的前体加工RNA的剪接和RNA催化活性RNA编辑⑴真核细胞每种转录产物都是各种RNA的前身，即无活性，亦无功能。⑵真核初级转录产物必须