蛇床子素对肿瘤细胞AGS中糖基转移酶β3Gn-T2及其相关基因表达的影响

苏州大学本科生毕业设计（论文）1蛇床子素对肿瘤细胞AGS中糖基转移酶β3Gn-T2及其相关基因表达的影响摘要目的胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率居各类肿瘤的首位,而近年来的研究表明蛇床子素具有明显的抗肿瘤的功能。但其作用靶点尚未完全明了。β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶8(β3GnT8即β3GalT7)是本实验室通过电子克隆得到的一个新型的人类糖基转移酶，通过同源序列比对确定其属于β3糖基转移酶大家族。本研究希望通过研究探索蛇床子素抑癌作用是否与影响糖基化（糖基转移酶）相关。方法以4种不同浓度的蛇床子素处理肿瘤细胞株AGS，观察经过处理后的β3GnT2mRNA水平表达的变化，在24h48h后RT-PCR检测β3GnT2mRNA的表达。结果随着药物浓度和时间增加细胞株AGSβ3GnT2的表达轻度降低.但在高药物浓度时，细胞株AGSβ3GnT2在48h比24h的表达有所提高。结论（1）蛇床子素可能通过下调肿瘤细胞中GnT2的表达影响细胞表面糖链结构，这种改变可能与蛇床子素诱导的肿瘤细胞凋亡有关。（2）肿瘤细胞对蛇床子素可能具有一定的耐药性关键词：蛇床子素；β3Gn-T2；AGS作者：沈立军指导老师：吴士良苏州大学本科生毕业设计（论文）2StudyontheeffectofOstholetotheβ3Gn-T2anditsrelatedgenesinTumorCellLinesAGSAbstract:Objectives：GastriccancerisoneofcommonmalignanttumorsinChina,theincidenceinourcountryranksfirstinalltumorOstholecankilltumorcells.β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase8isanewmemberofglycosyltransferaseswegainedbyelectriccloning.Weconsidereditbelongstobeta-3glycosyltransferasefamily.ThisresearchisfocusontherelationbetweenOstholeandβ3Gn-T2.Methods：Tostudythevariationofβ3Gn-T2anditsrelatedgenesexpressioninAGScelllinesafterOstholeaddedtotheculturemedium．UseRT-PCRtodetectthemRNAexpressionofGnT2inAGScelllineResults：AfterOstholeaddedtotheculturemedium，themRNAexpressionsofGnT2,inAGScelllinedecreased,butatthehighdrugconcentration，thecelllineAGSβ3GnT2in48hhavemoreexpressionthanin24hConclusion：（1）ThisstudyshowedthattheexpressionofGnT2aredifferentinthecelllineafterOstholeaddedtotheculturemedium．ThisresultsuggestedthattheeffectofOstholemaybechangethesugarchainsofglycoproteinincellsurface.（2）tumorcellsmayhavesomeresistancetowardsOstholeKeyWordsOsthole;β3GnT2；AGSWrittenby:LijunShenSupervisedby:ShiliangWu苏州大学本科生毕业设计（论文）3目录1前言…………………………………………………………………12蛇床子素对肿瘤细胞中β3Gn-T2及其相关基因mRNA表达的影响……………………………………62.1实验方法…………………………………………………………62.2实验结果…………………………………………………………93讨论…………………………………………………………………114缩略词表……………………………………………………………135致谢…………………………………………………………………15苏州大学本科生毕业设计（论文）4前言蛇床子系伞形科蛇床子属植物蛇床的果实,有温肾、壮阳、燥湿、祛风、杀虫之功效,具扶正祛邪双重益处。蛇床子素(osthole,OST,欧芹酚甲醚),别名为喔斯脑,系从蛇床子中提取的一种香豆素类化合物,其化学名为72甲氧基28异戊烯基香豆素[1]。是最先从伞形科植物中提取分离出的天然香豆素类化合物，伞形科植物蛇床的干燥成熟果实蛇床子(Fructuscnidii)中含量较高，故而得名。现代药理实验研究表明，蛇床子素具有抗骨质疏松症、抗高血压、抗心律失常、抗衰老、抗肿瘤、抗凝血、抗菌、杀虫、抗炎镇痛等功效.[2]经过实验研究,我们发现蛇床子(cnidiummon2nieril.Cuss)提取液有较强的抑瘤作用。目前已知蛇床子中有8种单体:棕榈酸(palmiticacid)、蛇床子素(osthole)、β2谷甾醇(β2sitosterol)、佛手柑内酯(bergapten)、异虎耳草素(isopimpinellin)、花椒毒酚(xanthotoxol)、欧芹属素乙(imperatorin)和花椒毒素(xanthotoxin),其中蛇床子素收得率最高。蛇床子素为香豆素类化合物,无色柱状结晶,蛇床子中含量0.8%,分子式C15H16O3。已知蛇床子素具有较强的抑制表皮藓菌的活性,并有一定的抗诱变作用,所以我们进一步对单体蛇床子素进行了抗肿瘤作用的研究。蛇床子素是蛇床子中含量较高的香豆素成分,日本学者Fijioka等[3]体外实验研究表明,蛇床子素对胃腺癌细胞MK21,人宫颈癌传代细胞Hela和B16F10细胞有明显的抑制活性,其ED50分别为8217,5310,6113μg·mL-1。周俊等[4]研究了蛇床子素对肺腺癌和肺鳞癌的体内抑制活性,并与水提液进行了抑癌活性比较。结果表明蛇床子素剂量为115μg·(g·d)-1对肺腺癌的抑制率为5010%,对肺鳞癌的抑制率为6915%,肺癌标志物DR270也有明显降低,与对照组比(P0101)。而蛇床子生药水提液对肺腺癌0111mg·(g·bw·d)-1组为4410%,0121mg·g·bw·d)-1组为5210%;对肺鳞癌0111mg·(g·bw·d)-1组为6713%,0121mg·(g·bw·d)-1组为8416%,该研究根据蛇床子素含量进行了苏州大学本科生毕业设计（论文）5剂量折算,蛇床子素与水提液2个剂量组之间存在可比性。粗制剂的活性好于蛇床子素,说明蛇床子素是蛇床子中主要抑癌活性成分,但还存在其他抑癌活性成分。所以本课题采取蛇床子素作为研究对象自然界中大多数蛋白质是以糖蛋白的形式存在的，其功能涉及细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发育、分化、神经系统和免疫系统恒定维持等方面[5]。糖基转移酶是广泛存在的一大类酶，它们决定了糖苷键的形成。自然界中所有寡糖、多糖和各种复合类(糖蛋白、糖脂等)中的糖部分。以及各类糖苷的生物合成均离不开糖基转移酶。糖基转移酶（Glycosyltransferase，GT）是一个庞大的酶家族，参与低聚糖和多糖的生物合成。它们将糖残基从活化的供体（通常是核苷酸糖）转移至受体，这些受体可能是脂类、蛋白或合成中的低聚糖[6]。已知糖基化异常与肿瘤密切相关，因此蛇床子素抗癌对糖基化是否有影响是令人深感兴趣的课题。本课题初步研究了蛇床子素处理后的胃癌细胞株AGS中β3GnT2的表达差异。对其细胞学表型功能进行初步探讨研究.苏州大学本科生毕业设计（论文）6蛇床子素对肿瘤细胞中β3Gn-T2及其相关基因mRNA表达的影响蛇床子素(osthole或osthol)又名甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚,其化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素,是从伞形科植物中提取分离的纯天然香豆素类化合物。研究表明蛇床子素具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗肝炎、抗变态反应、抑制血小板聚集,以及抗病毒、抗诱变等多种药理活性。我们对其体外抗肿瘤活性进行了研究材料与方法一、材料（一）主要试剂（1)、小牛血清购自上海华美生物公司(2)、胎牛血清购自Gibco-BRL公司(3)、IMDM完全培养基：每升IMDM基础培养基（Gibco，美国）中，添加小牛血清100ml、L-谷氨酰胺0.15g、NaHCO32.0g、葡萄糖3.6g、HEPES（Amresco，进口分装）4.7g；(4)、DEPC购自上海华舜生物工程公司(5)、Oligo(dT)、Trizol、RNaseInhibitor、SuoercriptIIRNaseHReversetranscriptase、TaqDNA酶、dNTPMIX（10mmol/L）、10×PCRbuffer、MgCl2（25mmol/L）购自Promega公司；(6)、琼脂糖、MixDNAmarker购自Fermentas公司；(7)、TRIzol购自Invitrogen公司。(8)蛇床子素（粉剂,杭州绿天公司,纯度95%以上）用DMSO溶解成20mg/ml，置于-20℃冷冻储存。（9）其余试剂均为国产分析纯设计引物采用Genetyx软件,并经GenBankBlast进行同源检索后合成。引物由Invitrogen公司合成。β−actin引物为：F：5'−CTCGTGCTACTCTCTCTTTC−3’，R：5'−CATGTCTCGATCCCACTTAAC−3’，预期扩增产物长度为211bp；β3GnT2的引物为：苏州大学本科生毕业设计（论文）7F：5’-CCAGAAGGCAAGCAAT-3’R：5’-TCCCGATGAGGTCCAG-3'，预期扩增产物长度385bp（三）主要仪器设备(1)、S2-160A分析天平（日本）(2)、65-1AC电子pH计（上海雷磁仪器厂）(3)、CO2培养箱（HeraesusBB5060）(4)、XSZ-D2倒置生物显微镜（重庆光学仪器厂）(5)、台式高速冷冻离心机（西德Eppendorf产品）(6)、紫外透视分析仪Bio-CAPTversion99(VLIBERLOURMAT)(7)、RT-PCR扩增仪GeneAmpSystem9600(PerkinELMER公司)(8)、752紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）(9)、电泳仪Mini-Protean3(Bio-Rad公司)(10)、18108石英管加热式自动双重纯水蒸馏器（上海玻璃仪器一厂）(11)、BI-1加热磁力搅拌器（上海斯奇分析仪器有限公司）二细胞培养人类胃癌细胞株AGS由本实验室保存，在含有10%小牛血清的F12中37℃、5%CO2培养箱常规培养。实验分为对照组和实验组。取对数生长期的细胞，传代贴壁后分别加入不同浓度的药物（6.25,12.5,25,50μmol/L），处理不同时间（1D,2D），收集细胞进行实验，进行逆转录PCR分析,以β-actin为内对照（416）,检测AGS细胞珠的β3GnT2的mRNA水平的表达的变化。三RT-PCR1总RNA的提取a．收集细胞，取细胞沉淀，加入1mlTRIzol，充分混匀，室温（15-20℃）静置5min，使细胞溶解。b．加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2min，4℃，12000rpm离心10min，可见液体分为三层。c．小心转移上层水相至一新的1.5ml离心管中，加500μl异丙醇颠倒混匀，在冰上静置10min，4℃，12000rpm离心10min。d．弃上清，加至少1ml75%乙醇（DEPC-treated双蒸水配制）（冰预冷）清洗沉淀，4℃，12000rpm离心5min。e．弃上清，加至少1ml无水乙醇清洗沉淀，4℃，12000r