蛋白类药物研究进展

《蛋白类药物研究进展》--1-1蛋白类药物1.1蛋白类药物概述现代生物技术的发展，使得蛋白质药物的大规模生产成为现实，这类药物应用于临床的数量也越来越多。蛋白质药物是指多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗。与以往的小分子药物相比,蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。[1]随着蛋白质化学和分子生物学的发展,用于各种疾病治疗的蛋白质类药物的研制和应用已成为生物医药产业发展的热点。多肽和蛋白类药物副作用小，活性强。并具有标本兼治的功效，而且由于其成本低、成功率高、安全可靠，[2]已成为医药产品中的重要组成部分。但是，蛋白类药物也有其稳定性差、膜通透性差、生物半衰期短等等缺点，影响了蛋白质药物的治疗潜力和临床应用。[3]1.2蛋白类药物的种类蛋白药物大致可以分为以下几类:多肽类激素药：包括人胰岛素、人生长激素、卵泡刺激激素和其他激素；人造血因子：包括重组人促红细胞生成素、粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF、人血浆蛋白因子：包括重组人凝血因子Ⅷ、重组人凝血因子Ⅶ、重组人凝血因子Ⅸ、重组人抗凝血酶等等。[1]--2-2蛋白类药物的研究现状生物技术的发展促进了大分子生物活性物质的发现，用于治疗或诊断的多肽、蛋白质、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等药物不断出现，国外已批准上市的生物技术药物产品约90多种，进入临床实验的生物技术药品有369种，占美国临床实验药品的1/3，正在研究发展的大分子活性物质或药物达千种以上，生物技术药物的销售增长率在1998年到2004年每年增长12%～15％，生物技术药物已涉足于200多种疾病，其研究多数是针对癌症治疗，以及传染性疾病、神经性疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病、艾滋病、自体免疫性疾病、皮肤病等。早在上世纪90年代，美国FDA即已批准可以进行临床研究的基因疗法达72种，年初国家食品药品监督管理局也批准了重组人p53腺病毒注射液的生产。由于半衰期短，生物技术药物的基本剂型是冻干注射剂或注射液，需要长期频繁注射给药，面对生物大分子在稳定性及吸收等方面的困难，在研究和生产高质量的冻干粉针及溶液型注射剂的同时，发展多种途径给药的新剂型是制剂工业和研究的重要任务。我国国家食品药品监督管理局也批准了重组人p53腺病毒注射液的生产。[4]2.1蛋白类药物的合成2.1.1化学合成法用化学法合成多肽主要依赖于固相肽自动合成仪，它是将氨基端被保护的第1个氨基酸的羧基结合到一个不溶性载体上，使之固定，然后脱掉该氨基酸的氨基端保护基，再将第2个氨基端被保护的氨基酸的羧基与固定的第1个氨基酸的游离氨基缩合形成不溶性二肽，如此反复进行，最后经化学降解和脱保护基后，从载体上脱落目的多肽。由于产率随每个氨基酸的缩合而递降，合成多肽的长度受到一定限制，一般在30～50氨基酸残基水平。目前，硫酯键介导的化学连接法已被成功地应用于较小蛋白质和蛋白质结构域的合成，其主要缺点是在连接位点需要特定的亲核性氨基酸残基。随着方法学的改进与发展，现在已经能够进行连续几个肽片断的连接，促红细胞生成素（EPO）变异体的合成就是一个成功的例子[5]。2.1.2化学—生物合成法化学—生物法合成蛋白质主要是利用分子克隆与生物工程技术将化学合成的小片断经特定的介导途径连接于大片断上，例如蛋白质内含子介导法，该法既解决了生物法合成的蛋白质局限于编码氨基酸又能避免化学合成法受到片断大小限制。近年来，已成功地合成了一些多肽与蛋白质。[6]--3-2.1.3利用(His)6标识辅助合成法最近有报道用(His)6标识辅助蛋白质合成的方法[5]。该方法既利用硫酯键介导，又根据固相肽合成原理将2个或多个大片断缩合成多肽或蛋白质，并利用(His)6tag与Ni2+-NTA-树脂的亲和性快速纯化合成蛋白质。Bang和Kent利用该法合成了Crambin和Tetrat-ricopeptiderepeat。然而，利用亲和纯化柱，不可逆吸附是不可避免的，因而导致产率不够理想。[7]2.1.4蛋白质内含子介导法合成法蛋白质自剪接是细胞内蛋白质生物合成中后转译水平上的一种加工过程，其主要元件是蛋白质内含子。自20世纪90年代蛋白质自剪接机理被阐明后，为利用蛋白质内含子介导蛋白质的连接奠定了基础。IPL不但可以连接化学合成的肽段，也可连接2个表达的大肽片断或蛋白质，大大拓宽了蛋白类药物制备的方法学。Arnold等首次成功地探索了IPL法半合成含有124个氨基酸残基的RNaseA。蛋白质内含子介导的蛋白质连接法在蛋白质的合成中具有重要意义：（1）它可以直接缩合大片段肽，而且产率高，从而使合成蛋白的大小远远超过蛋白介导的蛋白质连接化学合成法；（2）通过该方法可以对蛋白质进行模拟转录后修饰，如糖基化、磷酸化等；（3）通过该法可在蛋白质中引入非天然序列，如非天然氨基酸残基、非天然辅助因子等；（4）对大分子蛋白进行分段连接与标记如荧光、同位素、生物素等，制备高分子质量标记蛋白质，可为NMR分析蛋白质构象提供样品。[8]2.2蛋白药物制剂及相关材料在蛋白药物制剂的研究方面，使用CDE乙交酯丙交酯的共聚物制备蛋白缓释制剂是比较成熟的方法。CDE是一种人工合成的生物可降解的无毒的聚合物材料，已经被美国药物食品监督管理局认定可以进入人体使用。用CDE制成的含甾体类抗生素药物炔诺酮和甲基左炔诺孕酮的微球注射剂在美国正在进行临床试用，不久可能进入市场。用于治疗乳腺癌和前列腺癌已经商品化，商品名叫垂普啉，每月注射一针，一般几针即可完全抑制癌细胞的发展。该产品在日本和美国的年产值达到100亿美元。此外，正在研究中的控释制剂很多。例如包埋骨生长因子的CDE棒用于促进骨再生。鼻粘膜吸收的微球喷雾剂或肠粘膜吸收的纳米粒子口服制剂、植入中耳内治疗中耳炎或用注射器注入眼玻璃体的内腔中治疗白内障吸除术后的感染等多种制剂。[9]多聚糖类，特别是右旋糖酐是目前研究最多的水溶性载体&它的特点是在体内的归宿与分子量的大小有直接关系，因此，可通过选用合适的分子量实现向某一特定靶器官定位。其分子中的麦芽糖和岩藻糖还具有肝细胞特异靶向性，可用于靶向控释制剂。此外壳聚糖、聚氨基酸等都有良好的生物降解性和可修饰性，用这些材料作为靶向药物载体的研究也越来越多。用分子生物学和发酵生物学相结合的方法合成了新的蛋白质基聚合物，该方法可通过发酵细菌的基因表达控制重复多肽单元的序列，达到对蛋白质聚合物的--4-预先编码，并对这类聚合物的潜在应用前景进行了研究，展现出激动人心的应用前景。[9]2.3给药系统2.3.1注射给药临床上采用的主要剂型。对于在溶液中较稳定的多肽，通过加入适当稳定剂及控制贮存条件可制成溶液剂。某些蛋白质（特别是经纯化后）在溶液中活性丧失，可考虑制成冻干剂。某些半衰期短的多肽，应用缓控释技术可以有针对性地保护其免受外部环境的破坏，减少给药次数，延缓药物释放。多肽、蛋白质类药物的剂量一般很小，但需要长期给药，这就为缓释微球制剂的应用提供了机会。将多肽、蛋白质类药物包封于微球载体中，通过皮下或肌肉给药,使药物缓慢释放,改变其体内转运的过程，延长药物在体内的作用时间，可大大减少给药次数，明显提高病人用药的顺应性。该类注射剂包括可注射的埋植剂、微球注射剂、长效脂质体。2.3.2非注射给药鼻腔内具丰富的毛细血管和淋巴管，上皮细胞薄且间隙大，因此，通透性高、吸收较好；鼻腔蛋白酶较胃肠中少，无肝脏首过效应。低分子量的小肽极易被吸收；对分子量较大的多肽，使用适合的吸收促进剂增加吸收。但鼻腔给药也存在局部刺激性和鼻腔堵塞、对纤毛的损害、剂量不易掌握等缺点。口服剂型是人们比较容易接受，也是使用比较方便的剂型。长期以来，一直认为蛋白多肽类药物在消化道中难吸收且易被破坏，难以制成口服剂型。但是，蛋白多肽类药物的吸收以及生物利用度仍是口服途径给药需要克服的问题。经过近年来的研究，对天然聚合物进行结构改造后作为药物载体，联合应用酶抑制剂，具有生物兼容性的吸收促进剂的发现等各种技术的发展都为研制口服有效的蛋白多肽类药物提供了更大的可能性。蛋白质及多肽类药物肺部给药与其他黏膜给药相比，具有以下优点：①酶的活性较低；②吸收总表面积大(100m2)；③有丰富的毛细血管网；④肺泡上皮细胞层很薄，只有0.1～0.2μm；⑤气血屏障较小，只有0.5μm左右。但是，相对于注射途径给药，蛋白质及多肽类药物肺部给药系统的生物利用度仍然很低。为了提高这类药物的生物利用度，一般采用以下方法:①吸收促进剂；②酶抑制剂；③对药物进行修饰或制成脂质体。眼部给药简单、经济，起效迅速。一般认为多肽分子量小于5000的微克级，不需要吸收促进剂，大于6000的毫克级，则需要吸收促进剂，否则将达不到有效血药浓度。其他的给药方法包括直肠、结肠、阴道、植入、经皮等方式，为延长作用时间、--5-避免酶的破坏或达到某些特殊的要求，还可制成微球、纳米粒、纳米乳、聚乙二醇蛋白质结合物等。2.4展望蛋白质药物的物理及化学的不稳定性和低渗透性是发展其制剂的主要问题，对于简单的冻干产品及溶液制剂而言，通过研究合理的生产工艺及设计优良的处方、使用适宜添加剂等能在很大程度上解决其稳定性问题。蛋白质药物复杂的注射系统多应用微粒控制释放，是目前蛋白质药物剂型研究中的方向之一。但由于生产及处方的原因，仍然遇到许多的困难，如微粒制备过程和应用中蛋白质的稳定性，载药量和包封率低，突释效应等。而作为非注射给药的蛋白质给药系统则问题更为复杂，除稳定性问题更为严重（如口服给药系统），渗透性差也仍然是有待解决的难题，通过剂型、酶抑制剂、稳定剂和促渗透剂等手段或其结合有助于这些问题的部分解决，但离有效治疗目标还相距甚远，同时这些添加剂长期使用的安全性仍需要认真评估。另外，在口服剂型的研究方面，还需要加强肝代谢及肝清除机制与蛋白质有效性关系的研究。我国制定的“十五”期间生物医药研究的重点方向之一就是多肽和蛋白质药物及其制剂，随着此类药物的开发逐渐增加，有更多的蛋白质药物进入临床和生产，改变蛋白质药物制剂品种单一，发展非注射给药系统及多种类型的注射给药系统是治疗和预防疾病的需要，也是科学技术发展之必然，我国在制剂领域中此类研究和开发起步不久，但我们正在努力缩小与国际研发水平的差距。总之，蛋白药物种类繁多，对于人类的保健以及疾病的治疗有着非常重要的意义,也给新世纪的产业的发展带来了无限生机。相信通过许多生物学家、化学家、材料学家、医学家、药学家等的共同努力，将会有更多的蛋白药物面世，为人类的生存和发展提供更多更好的保证。[10]--6-3参考文献[1]任立华,刘忠,等.重组蛋白药物的研究进展[J].齐鲁药事.2008(10):677-678.[2]黄健,高春生,等,多肽和蛋白类药物口服给药的可行性探讨[J].国际药学研究,2007,34(4):298.[3]李招发.蛋白质药物口服的研究进展.生物技术通报.2011(6):21.[4]平其能.蛋白质药物新剂型的研究和进展[J].食品与药品,2005(7):51-55．[5]KochendoerferGG,ChenSY,MaoF,etal.Designandchemicalsynthesisofahomogeneouspolymer-modifiederythropoiesisprotein[J].Science,2003,299:884-887.[6]AyersB,BlaschkeUK,CamareroJA,etal.Introductionofunnaturalaminoacidsintoproteinsusingexpressedpro-teinligation[J].Biopolymers,2003,51:343-354.[7]BangD.KentSBH.His6tag-assistedchemicalproteinsynthesis[J].ANAS,2005,102(14):5014-5019.[8]XuMQ,SouthworthMW,Mersha,FB,etal.Invitroproteinsplicingof