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实验一坐骨神经腓肠肌标本制备目的学习坐骨神经腓肠肌标本的制备方法。原理两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织所需要的生活条件比较简单，易于控制和掌握。因此在生理实验中常用蟾蜍的神经肌肉标本来观察兴奋性、兴奋过程、刺激的规律以及骨骼肌收缩的特点等。实验对象蟾蜍实验用品蛙类手术器械、烧杯、培养皿、棉球、纱布、细丝线、任氏液、粗剪刀、蛙板等。实验步骤1.破坏脑和脊髓左手持蛙，用食指压其头部前端，使头前俯。右手持探针由头端沿正中线向后划，触到凹陷即为枕骨大孔，将探针由此垂直刺入。再将探针折向前方，插入颅腔内并左右搅动捣毁脑组织。再将探针退回至进针处，针尖转向后方，刺入椎管捣毁脊髓。此时蟾蜍四肢瘫软，表明脑脊髓已完全破坏。2.剪除躯干上部及内脏用粗剪刀在骶髂关节水平以上1cm处剪断脊柱。左手握住后肢，右手持剪刀沿脊柱的断口向下剪开两侧的皮肤及肌肉，再剪除已下垂的躯干上部及内脏。3.剥皮剪掉肛门周围的皮肤，左手捏脊柱断端（勿触碰神经），右手捏住断端边缘的皮肤，向下剥掉两后肢皮肤。将标本背位放于表面有少许任氏液的蛙板上，洗净双手及用过的器械。4.游离坐骨神经沿脊柱两侧用玻璃分针分离坐骨神经，用线在坐骨神经靠近脊柱处结扎并剪断。左手捏住脊柱，右手持剪刀从背面剪去向上突出的尾骨。然后从腹面沿中线将脊柱剪成两半。捏住两侧下肢带骨用力向两侧掰，使耻骨联合处脱臼，再从耻骨联合中央剪开两后肢，一后肢放入盛有任氏液的平皿中备用，一后肢用玻璃分针划开梨状肌及其附近的结缔组织，循坐骨神经沟（股二头肌与半膜肌之间的裂隙处）找出坐骨神经的大腿部分，用玻璃分针将腹部的坐骨神经小心勾出来，手执结扎神经的线，剪断坐骨神经的所有分支，一直游离至膝关节。5.完成坐骨神经腓肠肌标本的制备将分离干净的坐骨神经搭于腓肠肌上，在膝关节周围剪掉全部大腿肌肉，并用普通剪刀将股骨刮干净，在股骨中部剪去`上段股骨。再在跟腱处以线结扎，剪断并游离腓肠肌至膝关节处，在膝关节以下将小腿其余部分剪掉。这样即制得附着于股骨上、具有坐骨神经支配的腓肠肌标本（见图11）。6.检查标本兴奋性用浸有任氏液的锌铜弓轻触坐骨神经，如腓肠肌发生收缩，表明标本兴奋性良好。如无锌铜弓，也可用中等强度单个电刺激作上述测试。将标本放在盛有任氏液的培养皿中待用。注意事项1.避免用力牵拉神经或用手、金属器械直接接触神经。2.游离腓肠肌时，必须保全其上的腓肠肌。3.实验过程中要随时检查标本兴奋性，以便及时发现失误。4.制备坐骨神经时，一定要把神经表面的结缔组织膜、血管、凝血块等清除干净。思考题1.为什么在制备坐骨神经腓肠肌标本过程中要不断滴加任氏液？2.试述刺激坐骨神经引起腓肠肌收缩的过程中包含哪些机制。3.如何判断制备的神经肌肉标本的兴奋性？实验二反射弧分析目的本实验利用脊蛙分析反射弧的组成和验证反射弧结构的完整性与反射活动的关系。原理在中枢神经系统参与下，机体对刺激所作的适应性反映称为反射。反射活动的结构基础是反射弧，它一般包括感受器、传入神经、神经中枢、传出神经和效应器五部分。反射弧的任一环节发生障碍或受到破坏时，该反射都将减弱或消失。实验对象蟾蜍实验用品蛙手术器械一套、支台、蛙板、培养皿、线、棉球、1%盐酸等。实验步骤及观察项目1.制备脊蛙并悬吊于支台上。2.用培养皿盛1%盐酸溶液，将蟾蜍左后肢的中趾趾端浸入盐酸溶液，观察其反应。再将右后肢的中趾趾端浸入盐酸溶液中，观察其反应。3.用浸透1%盐酸的滤纸片粘贴在蟾蜍下腹部，观察是否右搔扒反射。4.在左后肢踝关节上方，将皮肤作一环行切口，剥去切口以下皮肤，重复2观察结果。5.在右后肢大腿部分离出坐骨神经并剪断，重复2观察结果。6.破坏脊髓后，重复2观察结果。实验结果实验讨论实验结论思考题1.在反射弧分析各项实验中，会出现什么结果，其机制是什么？2.用盐酸溶液浸趾尖引起的屈腿反射的反射弧包括哪些具体组成部分？实验三离体蛙心灌流目的学习离体蛙心灌流方法，观察内环境理化的相对恒定对维持心脏正常节律性活动的重要作用。原理心脏的正常活动，需要有一个合适的理化环境，离体蛙心在模拟其内环境条件下，如氧和营养物质的供应，适宜的无机盐离子浓度、酸碱度、渗透压、温度等。可以较持久的维持其生理特性。蛙的心脏无冠状循环，其心脏的血液供应直接来自心室腔，将插管直接插入心室腔，管内充以任氏液，在一定时间内，心脏仍然能维持其正常的跳动，改变灌注液的成分，则可引起心脏活动的改变。实验对象蟾蜍实验用品蛙类手术器械、蛙心灌流插管、蛙心夹、蛙心灌流杠杆、刺激器、蛙板、乳头吸管、图钉、棉球、线、烧杯、任氏液、双凹夹、描笔、0.65%NaCl溶液、2%CaCl2溶液、1%KCl溶液、0.01%肾上腺素、0.01%乙酰胆碱、2.5%NaHCO3、3%乳酸，张力换能器等。实验步骤1.动脉插管法（1）暴露心脏：取一蟾蜍，用刺蛙针捣毁脑脊髓，仰卧于蛙板上。约在肩带下方1～2cm处用镊子夹起腹部皮肤，用粗剪将皮肤剪去一块呈顶端向下的等边三角形，用镊子夹住后胸骨，剪去同样大小的一块肌肉（连同中胸骨、上啄骨、啄状骨、前啄骨和锁骨在内）暴露心脏。（2）识别蛙心各部分，用小镊子夹起心包膜，沿心轴剪开心包膜，识别左右心房、心室、动脉圆锥、腹侧主动脉干及其左右分支、静脉窦、前后腔静脉等结构，观察心室在收缩时容积减小，颜色变为浅红色，舒张时容积增大，颜色变红。（3）蛙心插管用蛙心夹在心房舒张时夹住心尖约1毫米。将蛙板倒转，使动脉干的左右分支靠近实验者。在动脉干分支处的稍上方穿过一线留作固定插管用。再在左侧分支下穿过一线，结扎之。用眼科剪刀在左侧分支靠近动脉圆锥处剪一斜切口（注意要剪破血管内膜，每次心室收缩时有血液自切口涌出，但不要把血管剪断）。取一管尖大小适宜的蛙心插管注少量任氏液入管内，左手用小镊子夹住切口缘，轻轻向上提，使切口扩大。右手持蛙心插管，自切口插入动脉干内。然后左手持左侧分支上的结扎线向后拉，右手推送蛙心插管，使之进入动脉圆锥。左手放松结扎线，轻轻向右提起蛙心夹上的连线，使心室于动脉圆锥成一直线。在心室收缩时，向前并略向左推动蛙心插管，便可以较顺利地插入心室。此时，每当心室收缩，插管中的任氏液液面上升，而心室舒张时，则液面下降，最后结扎插管并将结扎线固定于插管侧面的小钩上，以防标本滑脱。提起插管，剪断左右侧分支、前后腔静脉等（注意勿损伤静脉窦及两心房），将心脏摘出。用任氏液冲洗插管以免凝血，反复冲洗至插管内任氏液完全澄清无色为止。在插管的下1/3处结一线作为标志，每次换任氏液使应使液面于此线相平。2.心室插管法（1）暴露出心脏之后，于动脉干下穿过二条线，一条向上将动脉结扎，一条向下于静脉窦远端结扎静脉。（2）摘出心脏，在心房及心室间用线打一虚结，用小剪刀由心尖向心室方向剪一约0.5cm长小口，深达心室腔内，然后持备好的蛙心插管直接插入心室内并将备用的虚结拉紧扎牢，将结扎线固定在插管侧面的小钩上。（3）同蛙心插管，固定于蛙心灌流杠杆上，心尖向上，将蛙心夹挟在心房上。.组装仪器观察项目1.正常心跳曲线分析2.吸出管内的任氏液，全部换上0.65%NaCl溶液，观察心跳的变化。3.将NaCl溶液吸出，换以任氏液，待心跳恢复到相对稳定状态后，加入2%CaCl2溶液1～2滴，观察心跳的变化。3.把含CaCl2溶液吸出，换以任氏液，待心跳恢复到相对稳定状态后，加入1%KCl溶液1～2滴，观察心跳的变化。4.把含KCl溶液吸出，换以任氏液，待心跳恢复到相对稳定状态后，加入0.01%肾上腺素溶液1～2滴，观察心跳的变化。5.把含肾上腺素溶液吸出，换以任氏液，待心跳恢复到相对稳定状态后，加入0.01%乙酰胆碱溶液1~2滴，观察心跳的变化。6.把含乙酰胆碱溶液吸出，换以任氏液，待心跳恢复到相对稳定状态后，加入3%乳酸l溶液1～2滴，观察心跳的变化。7.把含乳酸溶液吸出，换以任氏液，待心跳恢复到相对稳定状态后，加入2.5%NaHCO3溶液1～2滴，观察心跳的变化。注意事项1.结扎静脉时，扎线必须放在静脉窦的下方，摘出心脏时勿伤及静脉窦。2.灌流管要确实插入心室腔内再结扎（如插管内的液面随心脏的跳动而搏动，则插管已插入了心室腔），扎线要固定在插管的侧管上以防脱落。3.要充分冲洗心室腔，以防凝血块赌住套管口。4.实验过程中，灌流的液面要保持相同的高度，记纹鼓的转速要保持不变。5.滴加每种溶液时要从最小量开始，待其充分扩散后，如作用不明显再补加，以防心脏受损。实验结果实验讨论实验结论思考题1.各种离子对心脏活动影响其机制是什么？2.任氏液为何能维持离体蛙心较长的时间的跳动？怎样才能使离体蛙心存活时间长？3.实验过程中，为什么必须保持蛙心插管内液面高度的恒定？液面过高或过低会产生什么影响？