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河南省地方标准DB41DB41/T602—2009蝴蝶兰组织培养技术规程2009-12-01发布2009-12-30实施河南省质量技术监督局发布DB41/T602—2009I前言为规范河南省境内蝴蝶兰的组织培养技术，结合我省生产实际和地域特点，制订本地方标准。本标准附录A、B为规范性附录，附录C为资料性附录。本标准由河南省济源市农业科学研究所提出并起草。本标准主要起草人：王梅、钟士传、李铭、陈丽、牛小沛、刘星明、陈火星。本标准于2009年12月01日发布。DB41/T602—20091蝴蝶兰组织培养技术规程1范围本标准规定了蝴蝶兰的组织培养技术相关定义、设施设备、组培技术、炼苗移栽等内容。本标准适用于河南省境内的蝴蝶兰组织培养。2定义下列定义适用于本标准。2.1植物组织培养从植物体分离出符合需要的器官、组织或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。2.2外植体由活植物体上切取下来以进行培养的器官、组织或细胞、原生质体。2.3培养基供植物外植体存活和生长所必需的介质，通常由水、无机盐、有机物质、凝固剂、糖以及植物生长调节物质等组成。2.4初代培养接种外植体后继代培养之前的培养。2.5继代培养对来自于初代培养获得的芽、原球茎等，通过分离切割并更新培养基，使培养材料数量上增加，并得到无根的幼苗。2.6生根培养把无根的幼苗转接到生根培养基中诱导生根，培养成生根苗的过程。2.7炼苗在保护设施中，采取逐步通风、控温、遮光等措施，使幼苗适应外界环境的过程。2.8变异在组织培养过程中受培养基和培养条件等影响，从外部形态上表现出有别于原品种的现象。3设施设备3.1组培设施与设备3.1.1组培设施一般由洗涤室、灭菌室、培养基配制室、无菌接种室、培养室、炼苗室组成。DB41/T602—200923.1.2仪器设备3.1.2.1洗涤室主要有自动或半自动洗瓶机、水槽、塑料箱、干燥箱、晾瓶架等。3.1.2.2灭菌室主要有高压蒸汽灭菌锅、器械消毒器、紫外灯、烘干箱、微孔滤器等。3.1.2.3培养基配制室主要有电子天平(0.0001g、0.01g)、量筒、微波炉、冰箱、移液管、烧杯、酸度计、容量瓶、药品柜、实验台等。3.1.2.4无菌接种室主要有超净工作台、或酒精灯、剪刀、镊子等。3.1.2.5培养室主要有培养架、紫外灯及控温、控湿、控时设备等。3.2炼苗移栽设施3.2.1温室要求冬季能加温，夏季能降温，能控制光照、温度、湿度等的日光温室、玻璃温室或PC板温室等。3.2.2温室设施主要有栽培床、灌溉设备、穴盘等。4组培技术4.1母株选择应选择观赏性状好、生长健壮、无病虫害、花期长的优良品种。4.2培养基配制及灭菌4.2.1培养基的选择常用MS和花宝培养基。4.2.2母液配制MS培养基一般由大量元素、微量元素、铁盐、有机物、调节物质等五大类。成分及用量见附录A。花宝培养基不用配制母液，直接使用。4.2.3培养基的配制4.2.3.1配料按培养基的配方及所需培养基的数量，分别吸取所需的母液及生长调节物质，加入称量好的蔗糖、琼脂以及其它需要的物质，如活性炭等，混合后倒入煮培养基的锅中，并加入少量的蒸馏水。4.2.3.2装瓶加热培养基至琼脂完全溶化，用蒸馏水将培养基定容至所需体积，并用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液调节pH。趁热把煮好的培养基分装入培养瓶，盖上培养瓶盖。分装时应不断搅拌，并不要把培养基沾附在瓶口。4.2.3.3灭菌将分装好的培养基放入高压灭菌器内，采用湿热空气灭菌法（灭菌压力0.11MPa～0.14MPa、温度120℃～126℃、时间15min～20min）进行灭菌。无菌水、接种工具（手术刀、镊子、垫纸等）也均采用此法灭菌。培养基高压灭菌取出后，置于室温至培养基凝固后即可使用。4.3外植体选择与处理4.3.1花梗侧芽选择与处理选取已开有少数花的健壮花序，切取带有芽的花梗节段，将其进行冲洗，用10%的漂白粉溶液表面灭菌20min，除去腋芽的苞叶，再在5%的漂白粉溶液中表面灭菌3min，无菌水冲4次～5次。4.3.2种胚培养选择与处理DB41/T602—200934.3.2.1种胚来源4.3.2.1.1授粉条件人工授粉时,首先要选好亲本,雌花最好的授粉时间是开花3d～4d。4.3.2.1.2授粉过程授粉时先将母本的花粉块除去,再将父本的花粉块用小镊子镊起,轻轻地放在母本的蕊腔上,因蕊腔中有粘液将花粉块粘附,不必担心花粉块脱落。4.3.2.1.3果实采收杂交后120d左右，当果实呈黄绿色时及时采收。4.3.3无菌处理果实采收后，用流动水冲洗干净，移到超净工作台上，用75%酒精浸泡8min～10min，再用10%漂白粉溶液中浸10min，然后用无菌水冲洗4次～5次。4.4接种4.4.1花梗侧芽接种在无菌纸上，用小刀切取0.5cm～1cm的茎段，转接到配好的诱导培养基。4.4.2无菌播种将果实放在无菌纸上，用手术刀剖开果实取出粉状种胚，将消毒后的种胚均匀地播种到无菌播种培养基上。4.5继代培养接种后1个月～2个月培养物即可形成芽或原球茎，转接到芽继代培养培养基：MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭1.5g/L+2%蔗糖+0.7%琼脂,PH﹕5.8或原球茎培养基上：花宝1号0.5g/L、蛋白胨2.0g/L、肌醇0.1g/L、磷酸三钙0.1g/L、香蕉100.0g/L、蔗糖20.0g/L、琼脂7.0g/L，PH﹕5.8。以后即发芽生根长叶。如要进一步扩繁，应在其发芽前把它切成小块进行转移，让它继续不断地形成原球茎球状体。4.6生根培养把无根幼苗转接到生根培养基1/2MS+BA1mg/L+NAA0.55mg/L+2%蔗糖+0.7%琼脂，pH﹕5.4。4.7培养条件光照强度2000Lx，光照时间每天13h，保持恒温25℃±2℃。4.8改进措施参照附录C。5炼苗移栽5.1温室消毒移栽前半个月，用1%的甲醛溶液对温室进行熏蒸消毒；用石灰水或高锰酸钾溶液对地面消毒；用高锰酸钾溶液对工具浸泡消毒。5.2炼苗长出2～3片叶子的生根苗即可进行炼苗。先将生根苗连同容器一起置于移栽设施中，放置1周，然后打开瓶口再放置2d～3d。5.3移栽5.1移栽时要求移栽前先将水草用1000倍的多菌灵或百菌清浸泡24h，使其充分吸收水分，然后用脱水机将其脱水至手握无水下滴即可用于移栽。移栽时小心取出生根苗,用清水洗去根部粘附的培养基,用水草包住幼苗根部移栽到穴盘中。5.4环境要求5.4.1空气湿度保持在80%～90%，遮光率50%,光照强度10000Lx左右,环境温度控制在22℃～26℃。DB41/T602—200945.4.2经1个月～2个月的管理,待小苗长出1～2对新叶时移栽到营养钵中。随着幼苗的生长,逐渐更换大的营养钵。5.4.3在小苗管理期间要经常喷水,但水苔不能积水或过湿,防止烂根。每隔2周～3周追1次稀薄液体肥料,定期喷洒杀菌剂,预防病害发生。DB41/T602—20095附录A（规范性附录）MS基本培养基配制用量表种类成分配1L母液称取量(mg)使用浓度(mg/L)配1L培养基吸取母液量（ml）大量元素硝酸钾KNO3190001900100硝酸铵NH4NO3165001650磷酸二氢钾KH2PO41700170硫酸镁MgSO4.7H2O3700370氯化钙CaCl2.2H2O4400440微量元素碘化钾KI830.8310硼酸H3BO36206.2硫酸锰MnSO4.4H2O223022.3硫酸锌ZnSO4.7H2O8608.6钼酸钠Na2MoO4.2H2O250.25硫酸铜CuSO4.5H2O2.50.025氯化钴CoCl22.50.025铁盐乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA.2H2O373037.310硫酸亚铁FeSO4.7H2O278027.8有机物肌醇1000010010甘氨酸2002盐酸硫胺素/VB1400.4盐酸吡哆醇/VB6500.5烟酸VB5或VPP500.5调节物质BA50依据各培养阶段取量NAA50蔗糖2000020000琼脂70007000pH5.8DB41/T602—20096附录B（规范性附录）蝴蝶兰组织培养工艺流程生根苗继代培养优良单株材料材料调整消毒外植体制作外植体接种初培养常温冷却凝固高压蒸汽灭菌培养基分装pH调整干燥培养基制作容器械洗涤无根芽苗清洗水草穴盘密集移栽过渡适应培养营养钵育苗基质配制容器移栽速生培育容器苗光照调节温度调节湿度调节环境消毒电导率测定消毒pH调节调节光照调节湿度生长剂调节温度根外追肥病虫防治施肥定植苗圃商品苗炼苗移栽DB41/T602—20097附录C（资料性附录）培养容器中培养物的表现、可能原因及改进措施表表C1培养阶段培养物的表现症状产生的可能原因可供选择的改进措施初代培养水浸状变色、坏死茎断面附近干枯表面灭菌剂过大；时间过长；外植体选用部位不当；时期不当试用较温和的杀菌剂，降低浓度、减少时间。试用其他部位，改在生长初、中期采样。长时间没有反应生长素种类不当；用量不足；温度不适宜增加生长素，增加2，4-D。调整培养室温度愈伤组织旺盛，疏松，后期水状生长素、细胞分裂素用量过大；培养温度过高；培养基渗透势低减少生长素、细胞分裂素用量，适当降低温度。愈伤组织生长紧密、平滑或突起粗厚、生长缓慢细胞分裂素用量大；糖浓度过高；生长素过量亦可引起减少细胞分裂素和糖的用量侧芽不萌发、皮层过膨大，皮孔长出愈伤组织选材样本过嫩，生长素、细胞分裂素用量过大减少生长素、细胞分裂素用量继代培养阶段再分化与丛芽苗增殖苗分化量少，速度慢，分枝少，个别长的高细胞分裂素不足；温度偏高；光照不足增加细胞分裂素，降低温度，苗分化数量较多，生长慢，部分畸形，节间短，苗丛密集，过度微型化细胞分裂素用量过多；温度不适宜减少生长素或停用一段时间，调节适当温度苗分化数量较少，苗畸形，培养较久苗可能在愈伤组织分化生长素用量偏高；温度偏高减少生长素用量，适当降低温度叶粗厚变脆生长素用量过高；或兼用细胞分裂素用量偏高适当减少生长素用量，避免叶接触培养基再生苗的叶缘、叶面等处，偶有不定芽细胞分裂素用量过高；亦或该种植物适宜于这种再升式减少细胞分裂素用量，或分阶段利用这一再生方式丛生苗过于细弱，不适于生根操作和移栽细胞分裂素过多；温度过高；光照不足；长时间不转接；空间小减少细胞分裂素用量，延长光照时间，增加光照，及时转接，降低温度培养阶段培养物的表现症状产生的可能原因可供选择的改进措施常有黄叶、死苗夹于丛生苗中，部分苗逐渐衰弱，生长停止瓶内气体状况恶化，pH变化过大；时间长不转接；糖以消耗；光合作用不足自身维持；瓶内乙烯含量高；培养物已污染；温度不适部分措施同上。去除污染，控制温度幼苗生长无力陆续发黄落叶，组织水浸状、熟状部分原因同上。植物激素配比不适，无机盐浓度不当部分措施同上。及时转接，适当调节激素配比幼苗淡绿，部分失绿铁盐不足，PH值不适，铁、锰、镁元素配失调，光过强，温度不适仔细配制培养基，注意配制配方成分，调好PH，控制光温条件DB41/T602—20098表C1（续）培养阶段培养物的表现症状产生的可能原因可供选择的改进措施培养阶段培养物不久生根，基部切口没有适宜愈伤组织生长生长素种类不适宜；用量不足；生根部位通气不良基因型影响；生根程序不适当；PH不适；无机盐度及配合不当等改进培养程序，选用或增加生长素用量愈伤组织生长过大过快，根部肿胀或畸形，几个根并联或愈合；苗发黄受抑制或死亡生长素种类不适；用量过高；或伴有细胞分裂素用量过高；程序不当等减少生长素或细胞分裂用量，改进培养程序等