蛋白质测定方法的比较

蛋白质测定方法的比较原理时间应用范围优缺点凯氏定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。8～10小时适用于0.2~1.0mg氮，误差为±2％用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩尿法双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。20~30分钟适用于1~10mg蛋白质用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似Folin－酚试剂法此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。40～60分钟倍）适用于~5mg蛋白质灵敏度高，耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。5～10分钟适用于50～100mg蛋白质用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用考马斯亮蓝法考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。5～15分钟适用于1～5mg蛋白质较好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线有轻微的非线性我的看法:关于蛋白质的鉴定方法在不断的更新进步,技术也在不断革新。考马斯亮蓝法是目前应用最广的方法之一，合适的方法为鉴定带来了诸多便利。所以我们需要在不断的思考和实践中进步。林学11-1110114130陈桂莲蛋白质检测双缩脲双缩脲试剂是由双缩脲试剂A和双缩脲试剂B两种试剂组成.双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1g/mL的水溶液；双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01g/mL的水溶液。双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在。具体方法是：先将双缩脲试剂A加入组织样液，摇荡均匀（必须营造碱性环境），在加入双缩脲试剂B，摇荡均匀。如果组织里含有蛋白质，那么会看到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的化合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，因蛋白质中也有-CONH-基也可用于检验蛋白质，与蛋白质接触后的颜色呈紫色。考马斯亮蓝科技名词定义中文名称：考马斯亮蓝英文名称：Coomassiebrilliantblue定义：属于三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；考马斯亮蓝G250是布拉德福德(Bradford)蛋白质定量试剂的主要成分。应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布目录化学性质考马斯蓝染色考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1.1．Bradford浓染液的配制：2.2．标准曲线蛋白质样本的准备：3.3．溶解：4.4．稀释：5.5．作用：6.6．计算：处理方法展开化学性质考马斯蓝染色考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1.1．Bradford浓染液的配制：2.2．标准曲线蛋白质样本的准备：3.3．溶解：4.4．稀释：5.5．作用：6.6．计算：处理方法展开编辑本段化学性质分子结构如右图CoomassiebrilliantblueG-250考马斯亮蓝有G250和R250两种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。编辑本段考马斯蓝染色coomassieblue一定范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。编辑本段考马斯亮蓝法测定蛋白质含量该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于细胞骨架的检验。1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇，加入100mL浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200mL，此染液放4℃至少6个月保持稳定。2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之间绘制标准曲线。3．溶解：将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。4．稀释：按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。5．作用：每个样本加5mL稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．6．计算：根据标准曲线计算待测样本的浓度。编辑本段处理方法考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。气相色谱法测定蛋白质,方法快速准确、灵敏、重现性好,操作简便,其最低检出限为0.5％