第十三章病毒学.

病毒：是一类超显微的非细胞生物，每一种病毒只含有一种核酸；它们只能在活细胞内营专性寄生；在离体条件下,它们以无生命的化学大分子状态存在。（真）病毒(virus)：至少含有核酸和蛋白质两种组分类病毒(viroid)：只含单独具侵染性的RNA组分拟病毒(virusoid)：只含不具单独侵染性的RNA组分朊病毒(prion)：只含蛋白质一种组分第十三章病毒1、概念2、病毒的特性形体极其微小，没有细胞构造，一般都可通过细菌滤器故也称分子生物；其主要成分仅是核酸和蛋白质两种；每一种病毒只含有一种核酸，DNA或RNA；既无产能酶系也无蛋白质合成系统，在宿主细胞协助下，通过核酸的复制和核酸蛋白装配的形式进行增殖；在宿主的活细胞内营专性寄生，在离体条件下，以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶；对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感。病毒与原核细胞型微生物的主要区别：微生物分类非细胞型原核细胞型培养条件活细胞多在无生命培基核酸DNA/RNADNA+RNA核糖体无有繁殖方式复制无性二分裂抗生素敏感性不敏感敏感干扰素敏感性敏感多不敏感病毒个体用纳米（nm）来量度。病毒的大小悬殊，直径在10～300nm之间，通常在100nm左右。较大的病毒如痘类病毒，其大小为250～300nm×200～50nm，比最小的细菌支原体（直径200～250nm）还大。最小的病毒如菜豆畸矮病毒，粒子大小仅为9～11nm，比血清蛋白分子（直径22nm）还小。一.病毒的大小与形态第一节病毒的基本性状成熟的具有侵染力的病毒颗粒称为病毒粒子，在电子显微镜下观察到的病毒粒子一般为球状、棒杆状、蝌蚪状和线状等多种形态。人、动物和真菌的病毒大多呈球状（如腺病毒、蘑菇病毒），少数为弹状或砖状（如弹状病毒、痘病毒）。植物病毒和昆虫病毒则多数为线状和杆状（如烟草花叶病毒、家蚕核型多角体病毒），少数为球状（如花椰菜花叶病毒）。细菌病毒称噬菌体，部分呈蝌蚪状（T2，T4，λ噬菌体），部分线状（fd、M13等）或球状（MS2、φX174等）主要由核酸和蛋白质组成。较复杂的病毒还含有脂类、多糖等。核衣壳（基本构造）核心：由DNA或RNA构成病衣壳：由许多衣壳粒蛋白构成毒包膜（非基本结构）：由类脂或脂蛋白构成刺突（非基本结构）衣壳粒是由一种或几种多肽链折叠而成的蛋白质亚单位，衣壳粒的排列组合方式不同，使病毒表现出不同的构型和形状。二、病毒的结构和化学组成衣壳核酸包膜刺突核衣壳病毒的基本结构：三类典型形态的病毒：•廿面体对称(球状)•螺旋对称(杆状)•复合对称(蝌蚪状)大肠杆菌的T4噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是病毒中复合对称的代表。①螺旋对称的病毒粒子TobacoMosaicVirus②二十面体对称病毒粒子Adenovirus③复合对称的病毒粒子T4Bacteriophage三、病毒的增殖一、病毒的复制周期病毒无完整的酶系统，只能依靠宿主活细胞，在原代病毒基因组控制下合成病毒核酸和蛋白质，装配成子代病毒，以不同方式释放出细胞外，再感染其他易感活细胞。病毒的复制具有周期性，一个完整的病毒周期包括：吸附、穿入与脱壳、生物合成、组装与释放。病毒周期吸附穿入脱壳生物合成组装释放1.吸附：离子间吸附：阳离子（如Mg2+）存在，是随机、可逆的吸附。特异性吸附：与细胞上的相应受体结合。2.侵入：通过细胞膜吞入——病毒胞饮（主要式）直接穿过、病毒囊膜与宿主细胞膜融合3.脱壳：在溶酶体蛋白水解酶作用下脱壳。4.生物合成：病毒DNA多在宿主细胞核内合成核酸。RNA多在宿主细胞浆内合成核酸。5.装配和释放：在细胞核内或细胞浆内装配→核衣壳。释放：A、“出芽”方式释放。B、宿主细胞破裂。(二)病毒的异常增殖1、顿挫感染非容纳细胞宿主细胞不能提供病毒复制所需的酶、能量或成份。病毒虽被复制，但不能装配释放2、缺陷病毒病毒基因组缺陷因病毒基因组不完整或有点突变而不能进行正常复制的病毒，当与辅助病毒共同培养，如能为其提供缺乏的物质，则缺陷病毒也能培殖。辅助病毒•腺病毒相关病毒（缺陷病毒）与腺病毒（辅助病毒）•丁型肝炎病毒（缺陷病毒）与乙型肝炎病毒（辅助病毒）四、病毒的干扰现象两种病毒同时或先后感染同一细胞时，一种病毒的增值可以抑制另一种病毒增值的现象，称为干扰现象。五、理化因素对病毒的影响灭活•病毒受理化因素作用后，失去感染性•灭活病毒仍保留某些特性，如抗原性、红细胞吸附、血凝和细胞融合等温度•病毒耐冷不耐热。-70ºC长期保存。冻融可杀死病毒•60ºC30min或100ºC数秒即可杀死病毒，但HBV需100ºC10min方可杀死•有包膜病毒比无包膜病毒对热更敏感pH•多数在pH5~9范围稳定•肠道病毒耐酸（pH3~5）射线X线、射线可将病毒核酸致死性断裂，从而杀死病毒（一）物理因素对病毒的影响（二）化学因素对病毒的影响脂溶剂：乙醚、氯仿、去氧胆酸盐•有包膜病毒敏感。无包膜病毒无作用（如肠道病毒）消毒剂：过氧乙酸、甲醛、戊二醛、卤素•杀死大多数病毒，但病毒对消毒剂抵抗力比细菌强，尤其是无包膜病毒•常用甲醛来制备灭活疫苗其他•抗生素：对病毒无作用•中草药：有一定作用1、水平传播(horizontaltransmission)病毒在人群不同个体间的传播，称水平传播。人群人群呼吸道、消化道皮肤粘膜、医源性第二节病毒感染与机体的免疫性一、病毒感染的途径与干扰类型（一）病毒感染途径通过皮肤传播：如经创伤、叮咬。通过粘膜传播：如经呼吸道、肠道粘膜、性接触等。医源性传播：如经注射﹑输血、拔牙等传播。2、垂直传播(verticaltransmission)病毒通过胎盘或产道，直接由亲代传给子代的方式，称垂直传播。病毒母体新生儿胎盘显隐胎受先流性性儿染天产感感正胎畸死染染常儿形胎经产道经血（二）病毒感染类型1、隐性感染：病毒在宿主细胞内增殖但不引起临床症状，称为隐性感染或亚临床感染。2、显性感染（急性感染与持续性感染）病毒在宿主细胞内增殖，引起明显临床症状，称为显性感染。（1）急性感染：感染时间短，宿主一般能将病毒彻底消灭而恢复。（2）持续感染：病毒在宿主体内持续存在较长时间，甚至终生，称为持续感染。▼慢性感染▼潜伏感染▼迟发感染：慢发病毒感染（三）病毒在体内的播散局部感染：如鼻病毒全身播散：感染机体血流、淋巴系统或神经系统向全身播散靶细胞中的易感细胞。如：麻疹病毒二、病毒的致病机理（一）病毒对宿主细胞的直接作用——细胞水平上致病机理（二）病毒感染的免疫病理损害——机体水平上致病机理1、溶细胞型感染2、稳定状态感染3、形成包涵体4、细胞凋亡5、细胞增生与转化6、病毒基因的整合(一)病毒对宿主细胞的作用病毒在细胞内增殖引起细胞裂解死亡多见于无包膜病毒：脊灰病毒、鼻病毒、腺病毒1、影响细胞的生命活力（1、溶细胞效应（杀细胞性感染）：CPE溶细胞感染2、稳定状态感染：（改变细胞膜结构）多见于有包膜病毒：流感病毒、疱疹病毒等稳定状态感染为特异性抗体或CTL细胞识别新抗原多核巨细胞3、形成包涵体概念：有些病毒感染细胞，在普通显微镜下可见胞浆或胞核内出现嗜酸性或嗜碱性、圆形或不规则的斑快结构意义：病毒感染的鉴别狂犬病毒包涵体（Negribody）4、细胞凋亡：诱导因子（如病毒等）细胞凋亡基因激活细胞膜鼓泡细胞核浓缩染色体DNA降解电泳时有阶梯式条带形成凋亡小体——增加基因突变的机会细胞核原因：病毒基因的整合细胞核细胞核1、逆转录病毒复制时以DNA整合入细胞染色体中；2、失常式整合，DNA病毒多见，病毒的DNA偶而以片段整合入细胞的染色体DNA中。5、细胞增生与转化结果：细胞增生或恶性转化（1）细胞增生：病毒细胞细胞内DNA合成加快细胞增生可能与肿瘤的发生有关（2）细胞转化病毒培养细胞细胞转化细胞形态变化繁殖加快成堆生长细胞癌基因：调节细胞生长、分化病毒癌基因：以前病毒的方式从细胞中获取细胞癌基因——致癌因素——活化癌基因——细胞转化（转化细胞不一定发生癌变）与人类肿瘤相关的病毒病毒科与人类相关的肿瘤病毒嗜肝DNA病毒肝细胞癌HBV疱疹病毒鼻咽癌EBVBurkitt淋巴瘤EBVKaposi肉瘤HHV-8乳多空病毒乳头状瘤HPV亚型宫颈癌HPV-16、18逆转录病毒成人T细胞白血病HTLV-1（二）病毒感染的免疫病理损害——机体水平上致病机理1、体液免疫的病理作用2、细胞免疫的病理作用3、免疫系统的功能被抑制4、自身免疫损伤三、机体的抗病毒免疫（一）固有免疫的抗病毒作用（非特异性免疫）（二）适应性免疫的抗病毒作用（特异性免疫）1、干扰素的抗病毒作用定义：由病毒或其他干扰素诱生剂刺激机体细胞所产生的一种具有抗病毒等作用的糖蛋白种类：种类产生细胞抗病毒抗肿瘤免疫调节人白细胞强弱弱人成纤维细胞强弱弱T细胞弱弱强I型II型抗病毒意义：抗病毒特点种的特异性、间接性、广谱性抗病毒机理：细胞受干扰素作用后，合成抗病毒蛋白（蛋白激酶、2，-5，合成酶、磷酸二酯酶）早期中断病毒复制，阻止病毒扩散2．NK细胞的作用NK细胞是一种不受MHC限制，也不依赖抗体的具有杀伤作用的免疫细胞。特点：溶解病毒感染细胞作用出现早非特异性1、体液免疫的抗病毒作用中和抗体——可中和病毒的感染（1）改变病毒表面结构或与病毒表位结合以阻止病毒的吸附；（2）与病毒形成免疫复合物有利于巨噬细胞的吞噬和清除；（3）有包膜病毒与抗体结合后，激活补体而使病毒裂解。（二）适应性免疫的抗病毒作用（特异性免疫）抗体的中和作用激活补体病毒裂解有包膜病毒2、细胞免疫的保护作用•病毒性感染主要靠细胞免疫•致敏T细胞——CTL、TDTH•CTL：直接杀伤或破坏表面带有特异性抗原的靶细胞•TDTH：再次接触病毒感染的细胞时，释放多种细胞因子1、标本采集与送检标本采集：早期；不同病变取不同标本标本处理：无菌操作；杂菌标本+抗生素冷藏速送：快速送检；冷藏（-700C）血清学标本：取双份血清，效价升高4倍有诊断价值第四节病毒感染的检查方法和防治原则二、病毒感染的快速检查方法1、形态学检查2、病毒抗原标志物的检查3、检查病毒抗体4、病毒核酸的检测光镜—大病毒、包涵体电镜—直接电镜、免疫电镜免疫标记技术—荧光素、放射性核素、酶ELISA——IgM核酸杂交技术Southern、NouthernPCR（三）病毒的分离培养病毒的分离培养动物接种（Animals）鸡胚培养（Embryonatedeggs）组织细胞培养（Organandtissueculture）病毒的鸡胚接种示意图尿囊腔接种羊膜腔接种流感病毒流感病毒尿液羊水血凝及血凝抑制试验鉴定病毒流感病毒+红细胞血凝流感病毒+特异抗体血凝被抑制初次再次鸡胚接种常用的细胞培养类型名称原代细胞培养恒河猴肾细胞培养，人胚肾、肺等细胞培养，鸡胚成纤维细胞培养二倍体细胞株WI-38（人胚肺细胞株），HL-8（恒河猴胚细胞株）传代细胞系Hela细胞，Detroit细胞（胸骨髓细胞系），ChangC/I/L/K（人结膜C，肠I，肝L与肾K细胞系），Vero（绿猴肾细胞系），BHK-21（幼地鼠肾细胞系）病毒增殖指标细胞病变效应(Cytopathiceffect,CPE)包涵体（InclusionBodies）多核巨细胞病毒的鉴定正常细胞CPE狂犬病毒包涵体（Negribody）巨细胞病毒包涵体光镜检查法用光学显微镜直接检查某些细胞包涵体巨细胞病毒包涵体麻疹病毒感染形成多核巨细胞狂犬病脑组织神经细胞胞质中包涵体（Ｎegri氏小体）等形态学检查电镜检查法用电子显微镜观察病毒颗粒的形态，适于检查含高浓度病毒的标本用于甲型肝炎病毒、轮状病毒等的检测近年来利用特异性免疫血清与标本混合孵育后，用免疫电镜法检测，提高阳性率用于轮状病毒、鼻病毒、甲型和戊型肝炎病毒、疱疹病毒等的检测形态学检查免疫荧光法（IFT）可快速、早期检测难以培养的病毒，如流行性出血热的汉坦病毒上呼吸道上皮细胞内的流感病毒、腺病毒和呼吸道融合病毒（ＲＳＶ），疱疹水疱液中单纯疱疹病毒抗原婴幼儿腹泻中的轮状病毒抗原等检查病毒性抗原免疫荧光法示意图酶联免疫吸附检测