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血凝项目标准操作规程1．一般注意事项1.1样品采集●静脉抽血；●穿刺要一针见血，避免淤血，气泡，溶血和组织液污染；●如果使用真空采集管，以第二或第三管样品为佳；如果从导管取样，则需用生理盐水冲洗管道，前面5ml血不能使用；●采血后立即与抗凝剂充分混合，尽快送往实验室；●采血量必须准确，如果少于计划量的90%，则不能使用；●不能在静脉穿刺部位或附近部位采样。1.2样品处理●使用3.8%或3.2%(W/V)枸橼酸钠溶液作为抗凝剂；●血样与抗凝剂的比例为9：1，如果血球压积﹤20%或﹥55%，则需调整这个比例，方法是：0.00815X血液毫升数X(100-压积)=抗凝剂毫升数；●血浆分离（如果不能立即测试，应尽快分离血浆）；——采样后60分钟内进行；——离心速度为1000g/10分钟●盛血浆容器应加塞，防止PH改变；●血浆应保存在2-8℃；●血浆存放时间不能太久；温度有效时间室温≤2hr2-8℃≤4hr-20℃≤2weeks-70℃≤6months●低温保存的样品，要在37℃迅速解冻，减低凝血因子的消耗，并立即测试。●与样品接触的所有器材（注射剂，样品管，检测杯等）必须采用塑料袋或硅化玻璃材质。●全部器材均不得含去污剂或清洗液。1.3影响测定结果的几种因素●抗凝剂：草酸钠、EDTA、肝素不适于作抗凝剂；●黄疸，脂血，重度溶血和冰冻血浆影响测定结果不准；●使用纤溶药物，如双香豆素，链激酶，尿酶等可使凝固时间延长；●超过治疗试剂量的肝素使凝固时间延长；●FDP增加使凝固时间延长；●某些药物，如口服避孕药，雌激素，天门冬酰胺酶，钠络酮等影响测试结果；●样本采集和处理不当，都会使凝固时间缩短或延长；●妊娠和急性炎症会影响某些测试结果。1.4干粉试剂及血浆溶解●保证干粉完全溶解；●溶解时，轻轻转动容器，避免剧烈震荡；●确认溶剂种类，一般溶解液包括：蒸馏水/生理盐水/缓冲液/厂家特定溶解液，按说明书选择；复溶后，室温放置5-10分钟后方可使用二．具体项目操作注意事项1.PT凝血酶原时间I.概述凝血酶原时间(ProthrombinTime)测定用来作为外科手术前对某一凝血因子的评价，以及用于监视抗凝治疗，当进行凝血酶原时间测试时，对于正常结果需有2、3级所有因子。因此，该实验对因子I、II、V、VII和X的量减少或不足是很灵敏的。除了因子IX，凝血酶原时间测试对于其它所有因子缺乏是灵敏的，它已被证明在监视抗凝治疗是有效手段。凝血酶原时间测定也用于因子II、V、VII和X的定量分析(因子分析)。II.试剂干粉试剂需复溶，液体试剂直接使用，使用前轻轻混合，可使用一些备件如搅拌。使用期间保持适当的悬浮液状态。如质控结果在范围之外，或试剂颜色发生变化，可能表明产品变质。然而，差的性能、结果也可能是由于其他因素包括试验系统引起的。警告：PT-DS试剂含有叠氮钠，勿服、勿接触皮肤和黏膜。III.样本收集3.8%(0.109M)枸橼钠做为抗凝剂。避免溶血和其他组织液的污染。样本体积不得少于所需体积的90%。在3000×g下离心10分钟，如样本在22—24℃下，须在2小时内测定。有关样本收集和储存的详细资料，请参见NCCLS文件。IV.步骤提供材料PT试剂另需材料：①纯化水②合适的计时器③精密移液管：0.1ml和0.2ml④正常和异常质控物，（凝血质控血浆三个水平)PT适合于手工、仪器、光度计和其它凝固的测定方法。手工方法A：在37℃预热PT试剂；B：加0.1ml血浆到比色杯中，在37℃下预热；C:用力加0.2ml预热的PT试剂到血浆中凝结形成，并记录时间建议至少使用一正常和一异常对照血浆，每40份病人样品至少一次轮换，逐日测定对照血浆，建议每个实验室应做好室内质控范围。V.结果用最近的0.1秒报告每个血浆的凝固时间，所得PT时间结果与正常参考范围值一起列入报告。(勿报告相对于商业质控血浆凝结时间的病人比值。质控仅仅是为了保证试验系统的准确性。)VI.局限性血凝生物化学包含一系列受许多预试验条件影响的反应。这些变异性必须被控制，以获得好的结果：样本收集勿延迟血液与抗凝剂的混合；避免样本产生泡沫；用塑料或硅硼酸盐玻璃容器；混浊、溶血、脂血或黄疸的样本，可能会引起错误结果；冷冻和解冻包含残留细胞血浆，会裂解细胞膜而影响结果；急性炎症反应由于纤维蛋白原的升高，会缩短PT结果；红细胞压积在20—55%范围以外，所加抗凝剂需调整比例。技术：如果血浆暴露到空气中pH将升高；PT工作要求37℃±0.5℃。经常检查加热部分的温度。在4—8℃保持的血浆可能会引起冷激活而导致PT缩短；所有的实验器皿必须清洁，没有脏物痕迹；按照仪器供应商的要求，保养仪器。影响物质：草酸钠，EDTA和肝素不适合做抗凝剂；口服避孕药物、天门冬氨酰胺酶、皮质酮、EDTA、红霉素、酒精、四环素和抗凝剂如肝素和华法令可能引起PT延长。抗组织胺药、布塔巴比妥、咖啡因、口服避孕药、苯巴比妥、维生素K.可能引起PT缩短。VII.期望值PT对正常人评估可获得以下结果平均±2SD范围仪器11.911.0—15.0可见光度计12.510.7—14.3这些值仅作为一个指导，每个实验室应建立自己的正常参考范围。试剂、仪器操作、血样收集技术或抗凝剂的改变，都应重新建立新的正常参考范围。有关性能特征、因子分析精密度等详见英文说明书。2.APTT测定试剂I.概述APTT(ActivatedpartialThromboplastintime)测试广泛应用已有数年，用作外科手术对某些凝结因子的评价，以及监视肝素治疗。当测定APTT时，所有内途径因子对于正常结果是必需的。然而它主要地用于检测2级因子的不足，即因子VIII、IX、XI和XII，以及Fletcher因子(4)。APTT测试也用于监视肝素治疗，测定结果显示延长0.1单位以上(5)。此试验也用在因子VIII、IX、XII和Fletcher因子的定量测度(因子分析)。II.摘要与原理APTT的延长直接与肝素量的增加成正比。APTT时间测定就是加入APTT试剂混合物在此37℃孵育3分钟“激活”，再加CACl2计数凝块形成时间。III.试剂试剂在2—8℃保存，勿冷冻，开瓶后在2—8℃可稳定30天。长时间储存后，可能会出现黄色沉淀。在使用前轻轻混合。不稳定值、超出质控范围之外的值或产品颜色变化，可能表明试剂变质。然而其它因素包括试验系统也可能引起这些误差。IV.样本收集3.2%(0.105M)或3.8%(0.109M)柠檬酸作抗凝剂，避免溶血和其它组织液体污染。样本体积不得少于所需体积的90%。在3000×g离心10分钟，如样本放在22—24℃下，需在2小时内测定。有关样本收集和储存的详细资料，请参见NCCLS文件。V.步骤提供材料：APTT试剂。另需材料：①美创公司提供的CaCl2(0.025M)，高纯度、高质量；②适当的计时器(秒表和时间表)；③精密移液管：0.1ml；④正常和异常质控，(凝血质控血浆，1、2、3、三个水平)APTT是适用于手工、仪器、光度计和其它凝结测定的方法。手工方法：A：在37℃预热CACL2(0.025M)；B：加0.1ml测定血浆到比色杯中，在37℃预热；C：加0.1ml预温过的APTT试剂入测定血浆中，混合；D：在37℃下孵育血浆试剂混合物3分钟。(激活时间)，为了试验的一致性，用同样的激活时间，测定所有血浆；E：用力加0.1ml预热的CACL2，凝结形成，注意凝块形成时间。用正常、异常质控血浆(如美创公司的质控三个水平1、2、3)与病人血浆结合起来测定。建议至少用一个正常和一个不正常血浆，至少每测20份病人样本轮换一次。VI.结果用最近的0.1秒报告每个血浆的凝结时间，所得APTT时间结果与正常参考范围值一起列入报告。(勿报告相对于商业质控血浆凝结时间的病人的值。质控仅仅是为了保证试验系统的准确性。)VII.局限性血凝生物化学包含一系列受许多预试验条件影响的反应。这些变异性必须被控制，以获得好的结果。样本收集：勿延迟血液与抗凝剂的混合；避免样本产生泡沫；用塑料或硅硼酸盐玻璃容器；混浊的溶血、脂血或黄疸的样本，可能引起错误结果；反复冷冻和解冻血浆，会损伤细胞膜，会影响结果；血胞压积在22—25%范围之外，所加抗凝剂需调整比例；技术：如果血浆暴露到空气中pH值将升高；APTT工作要求37℃±0.5℃，经常检查所有加热部分的温度；所有的试验器皿必须被清洁，没有赃物痕迹；按照仪器供应商的要求，保养仪器。影响物质：草酸钠，EDTA和肝素不适合作抗凝剂；口服避孕药物，雌激素，怀孕，氧杂萘邻酮类的药物，肝素，天门冬氨酰胺酶和naloxone已有报道报告会影响APTT结果。VIII.期望值APTT-LS正常人可获得下面结果：平均±2SD范围仪器28.624-38可见光度计26.023.4—28.6这些值仅作为一个指导，每个试验室应建立自己的正常参考范围。试剂、仪器操作、血样收集技术或抗凝剂的改变，都应重新建立新的正常参考范围。3.纤维蛋白原采用clauss法，即在待检稀释血浆中加入高浓度的凝血酶，血浆凝固时间与血浆纤维蛋白原浓度成反比。二、试剂及材料准备1.冻干牛凝血酶(100NIHUnit/ml)干粉或液体2.纤维蛋白原参比血浆1.0ml/瓶，3瓶/盒该制剂系人枸橼酸钠抗凝血浆，加入稳定剂和缓冲液后冻干而成。使用前用蒸馏水溶解，轻轻摇动至完全溶解。2—8℃存放可以稳定一周，也可-20℃冻存，避免反复冻溶。3.咪唑缓冲盐水(pH7.4±0.2)135ml/瓶，1瓶/盒该缓冲液以叠氮钠为防腐剂，叠氮钠如遇酸将产生有毒化合物，因此，含有该剂的容器、试管及丢弃的试剂均应用大量流水冲洗。此外，亦应避免该试剂在金属管道内沉积。4.塑料试管(自备)5.移液器100μl、200μl(自备)6.正常及异常质控血浆(自备)7.双对数坐标纸三、方法(一)标准曲线的制备1.稀释的纤维蛋白原参比血浆的制备将已知浓度的纤维蛋白原参比保存浆用咪唑缓冲盐水稀释成1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶40，5个浓度。2.每稀释度各取0.2ml、37℃预热5分钟，然后加入室温的凝血酶，记录各稀释度的血浆凝固时间。每稀释度重复2—3次测定，取平均值。3.以各稀释度纤维蛋白原的浓度为纵坐标，对应的血浆凝固时间的平均值为横坐标，在双对数坐标纸上绘制标准曲线，每条标准曲线至少应包括所做的5个稀释度中的连续3个以上的点。否则结果不予接受，应重新绘制。(二)标本的测定1.标本采集：3.2%或3.8%的枸橼酸钠1∶9抗凝全血，以RCF3000×g离心10分钟，分离血浆待检。在室温条件下，标本存放不应超过2小时，2小时不能完成检测，应冻存。2.测定步骤①待检标本用咪唑盐水1∶10稀释。②取1∶10稀释的血浆0.2ml、37℃预热5分钟，然后加入0.1mL已预热的凝血酶试剂，记录血浆凝固时间。③根据血浆凝固时间在标准曲线上查得标本的纤维蛋白原浓度。④若血浆凝固时间超出标准曲线的范围，若过长将标本作1∶5稀释,过短改作1∶20稀释，重新测定凝固时间，如标本作1∶5稀释，将从曲线上查得结果除2，如标本作1∶20稀释，将从曲线上查得结果乘2，得到最终结果。四、参考范围2.0g～4.0g/l(200～400mg/dl)五、注意事项1.分离的血浆中不应含有细胞成分；2.纤维蛋白原含量低于1.5g/l，而血浆FDP含量明显增高时，可致标本的测定结果较实际结果低；4.TT测定一、样本收集A.抗凝细胞压积剂：3.2%枸橼酸钠血样与枸橼酸盐的比例为9∶1。然而，对于个别病人血细胞压积低于20%或高于55%，须调整这个比例以保证获得结果。下面公式用来计算调整抗凝剂的量。0.00185×血液(ml)×(100-血细胞压积)=抗凝剂(ml)B.样本收集：血样可用针刺或其它方法取得。针刺是非损伤性的，避免溶血或其它组织液的污染。C.样本处理：血液收集后立即用抗凝剂轻轻混合，用RCF3000×g离心10分钟，过多血小板污染的血浆可能会引起一些因子水平假性升高，包括纤维蛋白原(因子1)，分离血浆勿使红细胞混入，或立即做实验。盖