血清白球蛋白的分离纯化及鉴定

血清白蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定分离纯化的一般程序选择材料破碎细胞提取分离纯化分析及鉴定（粗分级，细分级）（预处理）实验目的通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白和γ-球蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能。实验原理1.初分级:血清经饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。2.脱盐:用凝胶色谱法除去分离样品中的盐类。3.细分级:用离子交换色谱法从白蛋白粗分离样品中提取纯化的白蛋白；从球蛋白粗分离样品提取纯化的γ-球蛋白。4.鉴定:用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。1.盐析原理:当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。•不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经离心后，可与白蛋白分离开。•影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。•逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。操作操作一、盐析－－白蛋白、γ球蛋白的粗分离1取0.5ml血清2取0.5ml饱和(NH４)２SO４溶液，缓慢滴入，边加边摇。3混匀后于室温中放置10分钟。48000r/min×10min5小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。6沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化γ球蛋白用。2.脱盐盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分，样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱盐方法，同时可将蛋白质转换到用于离子交换层析的低离子强度缓冲液中。凝胶过滤的原理洗脱液中蛋白质及盐分的检查取96孔板一块，上四排加20％磺基水杨酸，下三排加BaCl2液。从下端管口取1滴洗脱液，滴于20％磺基水杨酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，开始收集蛋白样品。从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl2中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。二、G-25凝胶层析脱盐（一）葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备（二）上样与洗脱：1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床)。2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整)。3、开下端出口，使样品进入凝胶床（刚好下降到凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量pH6.5的0.02mol/LNH4Ac4、放开，流速约20滴/分钟，立即收集并检测，20％磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，10滴/管。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。5、BaCl2检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。6、平衡再生：继续洗脱30ml。7、白蛋白样品脱盐。15滴/管，收集三管。3.纯化离子交换色谱是蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。原理：离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带有相反电荷的离子（反离子）结合。当流动相中存在其他相反电荷的离子时，就与结合在固定相交换基团上的反离子进行交换。阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作为离子交换基团，能吸附流动相中的阳离子。阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作为离子交换基团，能吸附流动相中的阴离子。++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-0.02MNH4AC++++++蛋白样品---------++++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-NH4+NH4+0.06-0.3MNH4AC--得到纯化的γ-球蛋白得到纯化的白蛋白γ-球蛋白带正电白蛋白,α、β球蛋白带负电阴离子交换剂三、纯化（阴离子交换层析）将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，用0.02mol/LNH4Ac缓冲液洗脱，分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，10滴/管，编号。（纯化的γ-球蛋白）继续洗脱30ml将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/LNH4Ac洗脱30ml。（去掉α、β-球蛋白，午餐休息1小时）改用0.3mol/LNH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（纯化的白蛋白）再生：0.3mol/LNH4Ac20ml，0.02mol/LNH4Ac40ml四、醋酸纤维素薄膜电泳检查（1（2）粗分的γ-球蛋白液（3）粗分的白蛋白液（4）纯化的γ-球蛋白液：由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位置（2次），每次点样时待干后再点。（5）纯化的白蛋白液样品：操作步骤：•１．准备与点样•2.电泳（点样面朝下，110V1h）•３．氨基黑１０B染色2cm粗糙面