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血清白蛋白的分离、纯化与鉴定实验目的•掌握血清白蛋白分离纯化的方法；•学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋白质的原理与操作；•学习检测蛋白质纯度的方法.原理与操作血清的制备粗白蛋白的分离白蛋白的纯化白蛋白纯度的检测留样：2，3留样：4,…留样：1一、猪血清白蛋白的初步分离•1.实验目的•掌握血液样品的正确处理和制备方法,•掌握血清白蛋白粗分离的一般方法。•2.实验内容：•采血；•血清分离；•盐析法分离血清白蛋白；•除盐•3.实验原理•血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总量的60％。•它是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。•此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛•不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况有所不同，可根据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。•本实验先用盐析法作初步分离。•盐析就是大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺,蛋白质分子所带的电荷被中和破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。•中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。•在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多，故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。奈氏反应•奈氏试剂是络盐K2[HgI4]加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐砖红色的溶液或沉淀•4.实验操作：•（1）收集血清：取2ml血液，4℃，3,000rpm离心15min，用移液枪吸取上清（血清）1ml至10ml离心管，留0.1ml（样1）至1.5mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；•（2）量筒量取9ml底液，用移液管逐滴加入，在加的过程中需不断的摇晃或振荡，4℃静置2h；（底液为50%的饱和硫酸铵溶液）；•（3）4℃，3,000rpm离心15min，收集上清，留0.5ml至1.5ml（样2）离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；•（4）用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（7-9滴，白蛋白的等电点），用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH＝4.5）的体积（0.11×V）；•（5）逐滴加入饱和硫酸铵（pH＝4.5），边加边振荡，4℃静置2h；•（6）4℃，3,000rpm离心20min，弃上清，沉淀用0.5mlpH7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解，留0.1ml至1.5ml离心管（样3），用于测定蛋白质含量和电泳；•（7）将剩余的0.4ml蛋白质溶液将透析袋中，放入pH7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4＋存在；（透析袋的制备：透析袋中部有不能碰，将两条用棉线扎紧）；•（8）NH4＋的检测（奈氏试剂检测）：取1ml透析液，加入5滴奈氏试剂，混匀，观察，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4＋存在，需继续透析；二、血清白蛋白的纯化1.实验目的：•了解离子交换层析的基本原理•学会用离子交换法分离纯化蛋白质。2.实验内容•离子交换柱安装，平衡，加样，洗脱，样品收集•3.实验原理•离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。•本实验采用的DEAE－纤维素离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨基乙基，适用于大分子的分离。•在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。•因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。•除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/LpH7.4醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE）一纤维素（阴离子交换纤维素之一）层析柱上，在此pH时，DEAE一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β球蛋白（血清白蛋白等电点为4.9，绝大多数。α及β球蛋白等电点均小于6）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。4.实验方法与步骤（1）装柱：将层析柱固定，保持垂直位。将浸胀的DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）；（2）准备60－100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节流速为1mL/min，蛋白质检测器调零；（3）上样：将透析袋剪开，用移液管转至凝胶面上，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内；（4）洗脱：采用连续梯度洗脱。接上恒流泵，用0.02～1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行梯度洗脱，收集；记录出现峰值的管号；保存样品。三、血清白蛋白纯度测定•1.实验目的•学习蛋白质纯度检测方法。•2.实验内容•聚丙烯酰胺凝胶电泳•3.实验原理•PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。•电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。•4.实验方法与步骤•（1）胶的制备编号溶液名称12%分离胶4%浓缩胶130%Acr–0.8%Bis2.0ml0.33ml2pH8.9Tris-HCI1.25ml-3pH6.7Tris-HCI-0.63ml410%SDS100ul25ul5TEMED2.5ul2.5ul610%AP50ul12.5ul7H2O1.65ml1.5ml总体积约5mL约2.5mL•（2）样品的处理：•向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液，充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴3min，取出冷至室温。•上样顺序：（1）标准蛋白；（2）样品准备步骤（3）收集的蛋白质溶液；（3）样品准备步骤（6）收集的蛋白质溶液；（4）－（X）：柱层析出现高峰的管号蛋白质；•加样量：20μl.•（3）电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后100V。•电极缓冲液：pH8.3Tris–Gly•（4）染色：脱色考马斯亮兰R-250，4h或过夜。•（5）脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）脱色2-6h。