血管生成抗体芯片研究麦冬多糖对内皮细胞瘦素表达的影响

第1页共11页血管生成抗体芯片研究麦冬多糖对内皮细胞瘦素表达的影响王硕1，冯怡1*，徐德生2，章漳1，丁侃3（1上海中医药大学中药学院上海201203；2上海中医药大学附属曙光医院上海200021；3中国科学院上海药物研究所上海201203）摘要目的：应用血管生成抗体芯片技术探讨麦冬多糖MDG-1对体外培养的人微血管内皮细胞(HMEC-1)瘦素表达的影响。方法：使用血管生成抗体芯片技术检测不同浓度MDG-1处理后人微血管内皮细胞中多种生长因子的变化情况，确定与其治疗冠心病和糖尿病作用相关的生长因子；然后利用RT-PCR方法检测MDG-1对瘦素mRNA表达的影响。结果：抗体芯片结果显示MDG-1对多种生长因子都有调节作用，其中0.2、1、10mmol/LMDG-1对瘦素蛋白表达均有明显的抑制作用，RT-PCR结果也表明MDG-1可以抑制瘦素mRNA表达。结论：MDG-1可以显著抑制人微血管内皮细胞瘦素mRNA和蛋白的表达，MDG-1治疗冠心病和糖尿病作用可能与调节瘦素表达有关。关键词麦冬多糖；内皮细胞；瘦素；血管生成抗体芯片中图分类号：R285.5，R587.1文献标识码：AEffectofPolysaccharidefromOphiopogonjaponicusontheexpressionofleptininendothelialcellsbyusingAngiogenesisAntibodyArraysWANGShuo1,FENGY11*,XUDe-sheng2,ZHANGZhang1,DINGKan3(1DepartmentofPharmacy,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China；2ShuguangHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China；3ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201203,China)资助项目：上海市教委重点学科（No.J50302）作者简介：王硕，男，博士研究生*通讯作者：冯怡，女，教授，博士生导师Tel：021-51322491E-mail:[e-mail]第2页共11页ABSTRACTOBJECTIVE:ToinvestigatetheeffectofapolysaccharidefromO.japonicus(MDG-1)ontheexpressionofleptinproteinandmRNAinhumanmicrovascularendothelialcells(HMEC-1)byusingAngiogenesisAntibodyArrays.METHODS:TofindoutthegrowthfactorsrelativewiththetreatmentofMDG-1oncoronaryheartdiseaseanddiabetes,theexpressionsof19cytokineswereevaluatedusingAngiogenesisAntibodyArrayswith0.2、1、10mmol/LofMDG-1inHMEC-1cells.Then,theexpressionofleptin,thegrowthfactordeterminedbyAngiogenesisAntibodyArrays,mRNAwasdetectedbyRT-PCR．RESULTS:AftertreatedwithMDG-1theexpressionofleptinproteinandmRNAinHMEC-1cellswassignificantlysuppressedincomparisonwithcontrolgroup(P0.01)．CONCLUSION:MDG-1couldsignificantlysuppresstheexpressionofleptinproteinandmRNAinHMEC-1cellsandleptinmightplayaroleinthetreatmentofMDG-1oncoronaryheartdiseaseanddiabetes．KEYWORDS:polysaccharidefromOphiopogonjaponicus；HMEC-1；leptin；AngiogenesisAntibodyArrays瘦素(1eptin)又称“消脂素”，是肥胖基因(obesegene)的产物，是由脂肪组织分泌的一种蛋白质激素，通过与其受体结合发挥抑制食欲、减少能量摄入、增加能量消耗、抑制脂肪合成、调节机体脂肪沉积的作用，Zhang[1]等于1994年首先阐明其基因、分子结构及生理作用。近年来的研究发现，瘦素与冠心病、2型糖尿病、肥胖、脂肪肝等多种生理病理过程密切相关[2]。麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬Ophiopogonjaponicus(Thunb.)Ker-Gawl.干燥块根，是常用滋阴中药，具有养阴生津，润肺清心的功能，临床用于冠心病、心绞痛、糖尿病的治疗取得一定疗效。麦冬多糖(MDG-1)为从麦冬中分离纯化得到的均一分子量β-D-果聚糖[3]，前期药理学研究表明，MDG-1具有抗心肌缺血损伤的作用[4]，并对治疗糖尿病一定的效果。血管生成抗体芯片技术是近几年国外快速第3页共11页发展并逐渐成熟起来的生物技术[5,6]，可以快速而准确地检测样本中多种生长因子的表达情况，国内还未见该技术的应用报道。在本研究中，借助血管生成抗体芯片技术的优势，我们对多种生长因子基因在MDG-1处理后人微血管内皮细胞中的表达情况进行了研究，发现瘦素可能是与MDG-1治疗糖尿病和冠心病作用相关的生长因子；而后又利用RT-PCR方法检测瘦素mRNA表达的影响，为进一步研究MDG-1作用机制提供依据。1材料与方法1.1仪器与器材FormaSeriesⅡ二氧化碳培养箱(美国Forma)；CKX41倒置生物显微镜(日本OLYMPUS)；5417R高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；F-4500紫外分光光度计(日本Hitachi)；Tanon3500凝胶图像分析系统(天能)；TranSignalTM血管生成抗体芯片试剂盒(美国Panomics)；细胞培养皿(美国Coming)。1.2药品与试剂相对分子质量均一的麦冬多糖MDG-1(自制，数均分子量3400)；MCDB131培养基、高灭活胎牛血清、L-谷氨酰胺、青、链霉素、0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液均购自美国Gibco公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂均购自美国Sigma公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；AMV逆转录酶、ExTaq酶购自TaKaRa公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS)自配；细胞培养用水为新鲜三蒸水；其它所用试剂均为分析纯。1.3细胞培养第4页共11页人微血管内皮细胞株(Humanmicrovascularendothelialcells，HMEC-1)购自中科院上海生化细胞所细胞库。采用MCDB131培养液（加入10%牛血清，100U双抗，20mML-谷氨酰胺，5gEGF)，在37℃，5%CO2条件下培养[7]。1.4血管生成抗体芯片实验1.4.1实验分组实验分为正常对照组和MDG-1组。取对数生长期HMEC-1细胞铺入6孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养，待细胞数达到106个/孔时，换无血清MCDB131培养液培养24h。然后正常对照组加入用无血清MCDB131培养液，MDG-1组加入用无血清MCDB131培养液配制的含0.2、1、10mmol/LMDG-1的培养液。1.4.2内皮细胞总蛋白的提取正常对照组和MDG-1组分别于加药后18h时提取蛋白，弃去培养液，使用RIPA裂解液（0.2%SDS，0.5%曲拉通100，0.5%脱氧胆酸钠，1mMPMSF，1%蛋白酶抑制剂）冰上裂解30min，4℃下14000rpm离心15min后取上清测总蛋白含量，调整使各组蛋白浓度一致。1.4.3血管生成抗体芯片检测根据抗体芯片试剂盒说明，在25°C条件下将芯片膜用3ml封闭缓冲液孵化1小时，移去封闭缓冲液，用4ml洗片试剂Ⅱ洗膜两次，弃去多余液体。加500μl样品于膜的蛋白面，室温孵化1～2h。倾去样品液，用4ml洗片试剂Ⅰ在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用4ml洗片试剂Ⅱ在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用滤纸吸去残留液。取出膜，用滤纸吸去残留液，装入新孔中，将血管生成抗体液用洗片试剂Ⅱ稀释至适当浓度加入孔中。室温下孵育2h后，用4ml洗片试剂Ⅰ在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用4ml洗片试剂Ⅱ在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用滤纸吸去残留液。同上方法准备第5页共11页辣根过氧化物酶稀释液并与膜接触，室温下孵育1h后，用4ml洗片试剂Ⅰ在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用4ml洗片试剂Ⅱ在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用滤纸吸去残留液。经化学发光，显影，定影。将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。1.5RT-PCR实验采用RT-PCR法检测MDG-1对瘦素mRNA表达的影响。取对数生长期HMEC-1细胞铺入6孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养，待细胞数达到106个时加入MDG-1，继续培养18h。用Trizol进行总RNA的提取，以Oligo(dT)18为引物进行逆转录，逆转录体系20l。逆转录反应体系如下：①DEPC水为9.5l，②5×逆转录buffer为4l，③dNTPs(10mM)为2l，④RNaseInhibitor为0.5l，⑤Oligo(dT)18为1l，⑥总RNA模板为1l，⑦AMV酶为2l。PCR反应按以下反应体系进行：①ddH2O为37.75ul，②10×ExTaqbuffer为5l，③dNTPs(2.5mM)为4l，④上游引物为1l，⑤下游引物为1l，⑥cDNA为1l，⑦ExTaq酶为0.25ul。反应体系50l。引物由上海生物工程公司合成，瘦素上游引物序列：5'-ATGCATTGGGGAACCCTGTGCGG-3'，下游引物序列：5'-TGAGGTCCAGCTGCCACAGCATG-3'，产物487bp。设h18sRNA为内参，上游引物序列：5'-GATATGCTCATGTGGTGTTG-3'，下游引物序列：5'-AATCTTCTTCAGTCGCTCCA-3'，产物236bp。循环条件为：变性94℃、30s，退火60℃、60s，延伸68℃、120s，终末延伸68℃、7min，共30个循环。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用计算机图像扫描分析系统测定电泳条带密度值，瘦素表达水平以该条带密度与内参基因条带密度的百分比(％)表示[8]。第6页共11页1.6统计学方法所有数据均以x±S表示，采用SPSS11.10统计软件进行统计分析，组间均数比较用t检验，多个样本均数比较用单因素方差分析。2结果2.1人微血管内皮细胞可以表达多种血管生长因子血管生成抗体芯片位点数据见图1，实验结果见图2。实验发现人微血管内皮细胞可以表达的生长因子共12个，分别为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，干扰素(IFN)，白介素-12(IL-12)，金属蛋白酶-1(TIMP-1)，金属蛋白酶-2(TIMP-2)，瘦素(Leptin)，肝细胞生长因子(HGF)，肿瘤坏死因子α(TNFα)，白介素-6(IL-6)，白介素-8(IL-8)，转化生长因子α(TGFα)。Fig.1Templateforthehumancytokinesforangiogenesisinthearray第7页共11页Fig.2Detectionofcytok