第十五章激光拉曼光谱分析

1第15章激光共焦显微拉曼光谱分析拉曼散射是印度科学家Raman在1928年发现的，拉曼光谱因之而得名。光和介质分子相互作用时会引起介质分子作受迫振动从而产生散射光，其中大部分散射光的频率和入射光的频率相同，这种散射被称为瑞利散射，英国物理学家瑞利于1899年曾对其进行了详细的研究。在散射光中，还有一部分散射光的频率和入射光的频率不同。拉曼在他的实验室里用一个大透镜将太阳光聚焦到一瓶苯的溶液中，经过滤光的太阳光呈现蓝色，但是当光束再次进入溶液后，除了入射的蓝光之外，拉曼还观察到了很微弱的绿光，拉曼认为这是光与溶剂分子相互作用产生的一种新频率的光谱线。因为这一重大发现，拉曼于1930年荣获诺贝尔物理学奖。拉曼光谱得到的是物质的分子振动和转动光谱，是物质的指纹性信息，因此拉曼可以作为认证物质和分析物质成分的一种有力工具。而且拉曼峰的频率对物质结构的微小变化非常敏感，所以也常通过对拉曼峰的微小变化的观察，来研究在某些特定条件下，例如改变温度、压力和掺杂特性等，所引起的物质结构的变化，从而间接推出材料不同部分微观上的环境因素的信息，如应力分布等。拉曼光谱技术具有很多优点：光谱的信息量大，谱图易辨认，特征峰明显；对样品无接触，无损伤；样品无需制备；能够快速分析、鉴别各种材料的特性与结构；激光拉曼光谱仪的显微共焦功能可做微区微量以及分层材料的分析（1μm左右光斑）；能适合黑色和含水样品以及高低温和高压条件下测量；此外，拉曼光谱仪使用简单，稳固而且体积适中，维护成本也相对较低。激光拉曼光谱是激光光谱学中的一个重要分支，应用十分广泛。在化学方面应可应用于有机化学、无机化学、生物化学、石油化工、高分子化学、催化和环境科学、分子鉴定、分子结构等研究；在物理学方面可以应用于发展新型激光器、产生超短脉冲、分子瞬态寿命研究等，此外在相干时间、固体能谱方面也有及其广泛的应用。15.1基本原理入射光与物质相互作用时除了发生反射、吸收、透射以及发射等光学现象外，还会发生物质对光的散射作用。相对于入射光的波数，散射光的波数变化会发生三类情况。第一类为瑞利散射，其频率变化小于3×105Hz，波数基本不变或者变化小于10-5cm-1；第二类为布里渊散射，其频率变化小于3×109Hz，波数变化一般为(0.1～2)cm-1；第三类频率改变大于3×1010Hz，波数变化较大，这种散射被称为拉曼散射。从散射光的强度看，最强的为瑞利散射，一般为入射光的10-3，最弱的为拉曼散射，它的微分散射面积仅为10-30cm2mol-1sr-1，其强度约为入射光的10-10左右。经典的物理学理论认为，红外光谱的产生伴随着分子偶极矩的变化，而拉曼散射则伴随着分子极化率的改变，这种极化率的改变是通过分子内部的运动（例如转动、振动等）来实现的。2不同于经典的物理学理论，量子理论认为，入射的光量子与分子之间的碰撞，可以是弹性的也可以是非弹性的。拉曼散射是光量子与分子之间发生的非弹性碰撞过程。在弹性碰撞过程中，散射光的频率保持恒定，分子与光量子之间没有能量交换，这就是瑞利散射，如图15-1a所示。但是，一旦分子和光量子之间发生了非弹性碰撞，它们之间就会有能量交换，这种能量交换可以是光量子转移一部分能量给散射分子，也可以是光量子从散射分子中吸收一部分能量，不管是其中的哪一种情况，都会使散射光的频率相对于入射光发生改变。图15-1a，15-1b中，E1和E2分别表示分子的初始态和终态的能量，光子吸收和放出的能量只能是散射分子两个定态之间能量的差值E=E2-E1。如果光量子将一部分能量传递给散射分子，光量子能量变低，此时光量子将会以较小的频率散射出去，其频率为=0-，称为斯托克斯线。对于散射分子而言，接受光量子的能量同时跃迁到激发态E2。如果散射分子已经处于振动或转动的激发态E2，入射的光量子将可以从散射分子中取得能量E（振动或转动能量），并以更高的频率散射，这时的光量子的频率为=0+，称为反斯托克斯线。因此，在拉曼光谱谱图中会出现三种类型的线（图15-2），分别是瑞利散射线，斯托克斯线和反斯托克斯线。瑞利散射线位于中央，频率为0，其强度最强；高频的一侧是反斯托克斯线，与瑞利线的频差为，低频一侧的是斯托克斯线，与瑞利线的频差也为。斯托克斯线和反斯托克斯线通常都被称为拉曼线，两者对称的分布在瑞利线的两侧，其强度比瑞利线的强度均要弱很多，约为瑞利线强度的几百万分之一。和斯托克斯线相比，反斯托克斯线的强度又要弱很多，这是因为大多数的散射分子处于基态，因此在拉曼谱图中很不容易观察到反斯托克斯线。拉曼散射频率常表示为0，称为拉曼频移，其数值取决于散射分子内部振动和转动能级的大小，因此拉曼光谱的频率不受激发光频率的限制。通过拉曼频移，我们可以很好的鉴别和分析散射物质。尽管拉曼频移与激发线的频率无关，但是其强度与入射光的频率是有关系的。因此为了获得质量较高拉曼谱图，选择合适的激发线也是非常重要的。图15-2散射光的频率分布315.2基本构成及其工作原理在检测拉曼散射光时，不可避免的会收到强度大于拉曼散射至少一千倍的瑞利散射光的干扰。提高入射光的强度，可以提高拉曼散射光的强度，但是也会提高瑞利散射的强度。因此，在拉曼光谱仪的设计和使用过程中，既要考虑增强入射光的光强，又要尽可能的抑制和消除来自瑞利散射的背景杂散光，从而最大限度地收集拉曼散射光，提高仪器的信噪比。典型的拉曼光谱仪由图15-3所示的五个部分构成。15.2.1光源目前拉曼光谱仪的光源己全部使用激光光源。入射光采用激光，具有强度高、单色性好、方向性好以及偏振性能优良等优点，应用于拉曼光谱仪的激光线的波长已覆盖紫外到近红外区域，例如氩离子激光器可以提供514nm的激光，Nd:YAG激光器可以提供1064nm的激光。15.2.2外光路为了更有效的激发样品，收集散射光，外光路常包括聚光、集光、滤光、样品架和偏振等部件。(1)聚光：聚光的目的是增强入射光在样品上的功率密度。通过使用几块焦距合适的会聚透镜，可使入射光的辐照功率增强约105倍。(2)集光：为了更多地收集散射光，通常要求收集透镜的相对孔径较大，一般数值在1左右。对某些实验样品可在收集镜对面或者照明光传播方向上添加反射镜，从而进一步提高收集散射光的效率。(3)滤光：在样品前面和后面均可安置合适的滤光元件。前置的单色器或干涉滤光片，可以滤去光源中非激光频率的大部分光能，从而进一步提高激光的单色性。在样品后面放置的干涉滤光片或吸收盒可以滤去瑞利线的大部分能量，从而提高拉曼散射的相对强度。安置滤光部件的主要目的是为了抑制杂散光以提高拉曼散射的信噪比。(4)样品架：样品架的设计一方面要保证能够正确和稳定的放置样品，另一方面要使入射光最有效照射和杂散光最少，特别是要避免入射激光进入光谱仪的入射狭缝，干扰散射光的检测。目前入射光光路和收集散射光方向的不同，样品架光路系统的设计可以分为垂直，斜入射，背反射和前向散射等。(5)偏振：和荧光发射光谱一样，拉曼光谱除了对散射分子进行拉曼频移以及拉曼强度的测量，还可以通过测量拉曼光谱的偏振性更好的了解分子的结构。在外光路中加入偏振元件，可以改变入射光和散射光的偏振方向以及消除光谱仪的退偏干扰。15.2.3色散系统图15-3拉曼光谱仪的基本结构4色散系统是拉曼光谱仪的核心部分，它的作用是将拉曼散射光按频率在空间分开。通常分为色散型和非色散型两种。前者包括法布里-珀罗干涉仪和光栅光谱仪，后者以傅立叶变换光谱仪为代表。目前主要使用光栅色散型光谱仪。光栅的缺陷是仪器杂散光的主要来源。15.2.4接收系统拉曼散射信号可以通过单通道和多通道两种方式接收。目前以电荷藕合器件图像传感器CCD（ChargeCoupledDevice）为代表的多通道探测器被广泛应用于拉曼光谱仪。15.2.5信息处理与显示微弱信号的处理方法包括相干信号的锁相处理，重复信号时域平均处理，离散信号的统计处理以及计算机处理。目前主要通用的是采用后两种方法相结合。最后通过记录仪或者计算机接口软件输出图谱。15.3实验技术拉曼频移不随入射光频率变化，只与样品分子的振动转动能级有关。其强度可表示为：204sin(/2)kkSLHN（15-1）式中，φk—在垂直入射光方向上收集到的拉曼散射光通量（W）；Sk—拉曼散射系数，约为10-28~10-29molsr-1；φ0—入射光照射到样品上的光通量（W）；L—与折射率和样品内场效应等因素相关的系数；H—样品被检测的体积；N—单位体积内的散射分子的数目；—拉曼光束在聚焦透镜方向上的半角度。利用公式15-1，可对散射分子的结构和浓度进行分析和研究。拉曼光谱和红外光谱均属于分子振动和转动光谱，红外光谱解析中的定性三要素（吸收频率，强度和峰形）对拉曼解析也适用。在许多情况下，拉曼频率位移的程度正好相当于红外吸收频率。因此红外测量能够得到的信息同样也出现在拉曼光谱中。但由于这两种光谱的分析机理不同，在提供信息上也是有差异的，极性官能团的红外谱带较为强烈，而非极性官能团的拉曼散射谱带较为强烈。例如，在许多情况下，C=C伸缩振动的拉曼谱带比相应的红外谱带强烈，而C=O的伸缩振动的红外谱带比相应的拉曼谱带更为显著。此外，分子的对称性愈高，拉曼光谱与红外光谱的区别就愈大。拉曼光谱技术具有自身的优点：①制样简单，气体样品可采用多路反射气槽测定。液体样品可装入毛细管中测定，不挥发的液体可直接用玻璃瓶装盛测量，固体粉末可直接放在载玻片上测试；②由于激光束的直径较小，且可进一步对焦，因而微量样品即可测量；③水是极性很强的分子，红外吸收非常强烈。但水的拉曼散射却很微弱，因而这对生物大分子的研究非常有利，此外玻璃的拉曼散射也较弱，因而玻璃可以用做窗口材料；④对于聚合物大分子，拉曼散射的选择定律被放宽，拉曼谱图上可以得到丰富的谱带；⑤拉曼光谱的频率不受单色光频率的影响，因此可根据样品的性质而选择不同的激发光源，对于荧光强的一些物质可以选择长波长或短波长的激发光。5图15-4Renishaw（inVia）激光共焦显微拉曼光谱仪实验室使用的是Renishaw（inVia）激光共焦显微拉曼光谱仪，由英国雷尼绍公司生产（见图15-4）。主要性能参数：可见光（514nm）和近红外（785nm）激光器及光路各一套，低波数到100cm-1，采用三点精确机械定位方式，计算机控制不同波长滤光片之间的自动转换。自动xyz三维平台，最小步长为0.1m，采用光栅尺反馈控制，确保高重复性，重复精度小于0.2m，可进行分散的多点、线、面的扫描和共焦深度扫描。具体实验操作步骤如下：1.开机1)打开主机电源2)计算机电源3)显微镜电源4)将使用的激光器电源a.4nm/633nm：打开控制模块电源开关-打开控制模块钥匙-打开功率显示模块钥匙。b.325/780nm：直接打开激光器电源开关。5)将Interlock盒开关选至所用激光器位置。2.自检1)用鼠标双击Gramns图标，进入仪器工作软件环境。2)点击菜单中的Collect命令，选择Systemcheck命令执行（或Collect-SystemSetup-General-CheckPositions），系统将自动检查所有的电机。时间大约要3-5分钟。3)用50倍物镜，1s曝光时间，50μm狭缝，514nm激光，100%功率取谱。使用标峰命令检查峰位。参数获得：a用鼠标左键选中主峰区域；b放大；c点击CRV命令按钮（或者菜单中Arithmetic命令，选最后一个CurveFit命令执行）；d用鼠标右键在谱峰内部任意一点点击，然后选择命令按钮Done；e选Iterate命令执行，StartFit，OK，执行ViewPeaks命令，再选择Parameters；此时能看到上述所有参数；f点击Parameters，Exit，Quit，Exit，退出此功能界面。g如果发现峰位偏差，可以用菜单中Collect--Application，执行第一项Calibratesystem，输入希望纠正的值，Apply--Done。6