第十五章目标产品的蛋白质分析检测.

第十五章目标产品的蛋白质分析检测技术与质量控制第三篇目标产品的分析检测技术与质量控制2本章的主要内容蛋白质含量和纯度氨基酸的分析蛋白质的分子量测定蛋白质的等电点肽谱蛋白质突变点的分析蛋白质的二硫键的分析3一、蛋白质含量和纯度•含量:mg/ml,mg/g材料•纯度:每单位重量样品中目标蛋白质占总蛋白的比例.是一个相对指标,可用百分比表示.一般指是否含有杂蛋白,而不包括是否含有盐、离子等小分子的物质。纯度等级可分为95%，99%和99.9%等。4蛋白质含量和纯度测定方法•含量测定:凯氏定氮法（繁琐）、TCA比浊法、双缩脲法（需样品量大,不够灵敏）、福林-酚法、紫外线法和考马斯亮兰法（Bradford法）。考马斯兰G-250法：此试剂在酸性条件下与蛋白反应，当吸收峰由465nm转移到595nm，灵敏度高，测定蛋白的浓度范围广。5•遗传工程产品蛋白质的纯度要求：95%、99%、99.9%。•常用鉴定蛋白纯度的方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE、毛细管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）、HPLC（包括凝胶过滤、各种反相HPLC、离子色谱、疏水色谱）6•新的方法：如质谱法，仅pmol的样品就能测定，同时能给出分子量。•注意：只用一种鉴定蛋白纯度的方法是不够，往往几种（方法，机理）结合使用。7五种蛋白质测定方法比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为2％费时8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法灵敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50～100g快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin－酚试剂法灵敏度高～5g慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法灵敏度最高1～5g快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化8二、氨基酸分析•检测法的种类：•氨基酸进行UV检测只能利用羧基（-COOH）在200～210nm处的吸收。一部分具有苯环的氨基酸也可在250～280nm检测，但是，一般对原物质（氨基酸）进行高灵敏度、良好选择性的分析比较困难。•因此，很早以来就使用衍生法，利用许多氨基酸构造中存在的氨基（-NH2，-NHR），使用与该基团可进行选择性反应的衍生试剂。•检测的仪器：HPLC或氨基酸分析仪9两类方法：•柱后反应法：•将游离的氨基酸经色谱柱分离后，氨基酸再与显色剂（茚三酮[吸光度检测]、荧光胺、邻苯二甲醛[荧光检测]）作用，然后导入检测器。•优点：①反应可自动化，定量定性、重现性优异。②由于反应前试样成分在柱中分离，“杂质”被去除，比较稳定。10•柱前衍生法：将各种氨基酸和荧光试剂先作用生成衍生物，再分离，直接检测衍生物的荧光。•特点：①反应系统小，试剂用量少。②可使用高价格的试剂，低背景，可提高灵敏度。③即使检测出未反应试剂，但经柱分离，也不会影响检测。11•氨基酸水解方法：•通常是5.7mol/LHCl真空状况下110℃水解24h，也有在150℃下快速水解4h。•不同条件下，各种氨基酸的回收有所不同，且有的氨基酸会遭受破坏（如色氨酸）。•保证氨基酸分析准确性的方法：①过去用胰岛素为标准样品来判断，②近年来采用“测试肽法”，即将20种常见氨基酸人工合成一个20肽。然后水解，每种氨基酸残基出现频率是1，易于校正回收。12三、蛋白质分子量的测定•早期方法：超离心、光散射法，需较高级仪器和较多的样品，现很少使用。•凝胶过滤法测蛋白质分子量。如Sephadex系列（G75、G100）等——HPLC凝胶过滤系统。测定是完整蛋白质分子量。•实验室常规方法：SDS-PAGE，用量约1ug，误差为5-10%，但方便。测定蛋白质亚基的分子量。13•新的方法：•毛细管电泳，仅需ng的量，分辨率和准确性均比SDS-PAGE好。•质谱，灵敏度和准确性都很好，精确度达0.01%。1415四、蛋白质的等电点•等电聚焦法：可以测定蛋白质的等电点，同时可鉴定蛋白的纯度。•毛细管等电聚焦法：能测定偏碱性的蛋白质的等电点，如天花粉蛋白的等电点测定。16•毛细管等电聚焦电泳-电喷雾质谱技术（CIEF-MS）：分辨率极高，能分辨的等电点差异小于0.04pH。一些标准样品用此法分析可发现亚型（分子量完全一样，等电点不同）的存在。如细胞色素C两个亚型分别为9.60、9.55。一般的方法根本无法分辨。1718五、肽谱•肽谱技术：是指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。1、裂解方法：用酶或化学法裂解蛋白质成肽段。酶解：①胰蛋白酶（切碱性氨基酸如Arg,lys的C端）②Lys-C内肽酶只作用于Lys-X键；③梭菌蛋白酶只作用于Arg-X键。④V8蛋白酶只专一作用于负电性氨基的C端（Glu,Asp）；在pH=4条件下，V8只作用于Glu-X键。19•化学裂解：•最常用的是溴化氰，作用于MetC端和其次一个AA的肽键。如γ-干扰素有4个Met，可被裂解成5肽段。•BNPS-3-甲基吲哚、N-氯代琥珀酰亚胺作用于Trp-X键上；•2-硝基-5硫氰基苯甲酸作用在X-Cys键上；•羟胺作用在Asn-Gly键上。202、肽谱分析•肽谱分析一般用HPLC和CE来进行：•HPLC主要是用RP-HPLC根据肽的长短和疏水性来分离。•当肽亲水性强，用HPLC不能滞留在柱内，达不到分辨效果；或当肽疏水性很强，粘在柱上洗不下来时，可用CE来进行。•SDS-PAGE：当裂解成的肽段较大时，可进行。当对于小分子肽时，往往无法分辨。•质谱分析蛋白质的酶解产物，多肽出现先后按分子量大小排列。21六、蛋白质突变点分析•天然蛋白质和突变蛋白质肽谱的比较•荧光标记Cys;•同位素标记法；•紫外吸收法22蛋白质突变点的分析•例子：人白细胞介素-2的突变点分析。133AA，第125是一游离Cys，第58位和第105位半胱氨酸形成二硫键（活性必需）。•鉴定IL-2的蛋白质工程(Cys-Ser/Ala)突变点：用TPCK-胰蛋白酶水解后，进行RP-HPLC分离分析。①天然IL-2和新型IL-2的酶解图谱比较寻找有差别的肽进行顺序分析；②荧光标记Cys残基，比较标记前后新型IL-2酶解图谱的差别，从而鉴别出点突变的肽；③同位素标记法；④利用IL-2只有一个色氨基酸，280nm主要是色AA吸收，其次是酪AA和苯丙氨酸，酶解后分别用214nm和280nm检测，可找到含色AA的肽段——用CE确定为均一——AA序列分析——证实新型IL-2的Ser（125）取代了Cys。23•新的方法：二阶微分光谱法和CE-MS联机来检测IL-2突变点，更快速和准确。24•酶解后，用液质分析，寻找与理论值分子量不一致的肽段。25七、蛋白质的二硫键分析•二硫键的错配，生物活性只有原来的1/400。•分析方法：①IL-2（3个Cys）：用同位素标记，pH=8.5用3H-碘代乙酸处理IL-2，只有游离的巯基才与其作用，然后还原，再用14C-碘代乙酸烷化。故如3H-标记仅在肽11上，14C-的放射性全在肽12和肽14上，则和天然结构是一致的。②SOD（3个Cys）:可用同样的方法。③直接分析二硫键的异构物。IL-2在碱性条件下形成二硫异构体（58与125位或105与125形成二硫键），反相色谱中，它们的疏水性弱些，较早被洗脱出来。26八、蛋白质的序列测定测定蛋白质的一级结构方法：•蛋白质化学法：（Edman降解法测定N端和羧肽酶或化学法测定C端）•cDNA演绎法•质谱法•二维核磁共振