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第十六章—细胞破碎(CellDisruption)生化分离过程的一般流程发酵液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性√√3.1概述胞外型：一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药、保健产品和工业用。这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固－液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。概述胞内型：几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α--干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力（物理、化学、酶或机械的方法）破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。概述微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。革兰阳性细菌细胞壁结构模式图革兰阴性细菌细胞壁结构模式图3.2细菌细胞壁结构和化学组成细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示意图）几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycanchain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。☆阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～3nm，占细胞壁成分的10％左右,由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层(约8～10nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。☆革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有20～80nm的肽聚糖层，约占细胞壁成分的40～90％，此外细胞壁还含有大量磷壁酸。酵母菌酵母菌一般有很高的营养价值，特别是含有50%蛋白质，很多B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物质。畜禽饲料(单细胞蛋白，SCP)食品添加剂（啤酒酵母）细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。植物细胞细胞壁的化学组成组分结构和分类纤维素β－1，4－D－葡聚糖半纤维素木葡聚糖甘露聚糖木聚糖果胶物质半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白质结构蛋白各种酶类凝集素组织捣碎匀浆机3.3细胞壁的破碎3.3.1破碎率的评价%100(%)00NNNY式中：N0（原始细胞数）N（经t时间操作后保留下来的未损害的细胞数）(1)直接计数法直接对适当稀释后的样品进行计数，可以通过平板计数技术或在血球细胞器上用显微镜观察来实现最终染色细胞的计数。(2)间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量(例如可溶性蛋白、酶等)。3.3.2细胞破碎的方法目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。破碎方式机械法非机械法固体剪切液体剪切作用作用珠磨法高压匀浆干燥处理溶胞作用酶溶法化学法物理法超声破碎压榨(一)机械法①高速搅拌珠研磨破碎法（Finegrinding）②高压匀浆破碎法（Homogenization）③超声波破碎法（Ultrasonication）研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。①高速搅拌珠研磨破碎法（Finegrinding）NetzschLM-20型珠磨机高速珠磨机工作原理水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在同心轴上的圆盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。在料液出口处，旋转圆盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。在珠磨法中，细胞的破碎率也能用一级速率方程式表示：ln[1/(1-R)]=KtK－破碎速率常数t－停留时间R－破碎率破碎速率常数K与许多操作参数有关，如搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠的装置和珠体的直径以及温度等。1.进入珠磨机的细胞浓度和负荷，料液的流速，搅拌器的转速和构型，以及温度等。这些参数不仅影响破碎程度，也影响所需能量。2.珠体的大小应根据细胞大小和浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择。3.珠体在磨室中的装量影响破碎程度和所需能量，破碎面包酵母菌适宜的珠体装量为80％，珠体量的增加使热扩散性能降低而引起温度升高。4.增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大，所以搅拌转速应适当。②高压匀浆破碎法操作原理:原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母菌等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合公式：ln[1/(l－R)]＝KNPα其中R：破碎率；K：与温度有关的速度常数；P：操作压力；N：悬浮液通过匀浆器阀的次数。a：与微生物种类有关的常数；高压匀浆法适用的范围酵母和大多数细菌细胞的破碎。料液细胞浓度可达到20%左右。☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。高压匀浆器破碎细胞升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约175MPa的压力下，破碎率可达100％，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢，在工业生产中，通常采用的压力为55~70Mpa。③超声波破碎法超声波破碎超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-20kHz的超声波探头处理细胞悬浮液,是一种液相剪切破碎法。超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波破碎的机理在相当高的输入声能下，液体各个成核部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直至不能再压缩时，气泡破裂，释放出猛烈的震波。震波通过介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。在液流中当某点压力低于液体所在温度下的空气分离压时，原来溶于液体中的气体会分离出来产生气泡，这就叫空穴现象。超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。影响因素：7）细胞悬浮液的流速：取决于停留时间影响总收率。1）振幅：直接与声能有关系。2）细胞悬浮液的黏度：影响能耗并会抑制空穴。3）表面张力：影响细胞破碎效率。4）被处理悬浮液的体积：体积大需要能量大。5）珠粒的体积和直径：添加细小的珠粒（研磨）。6）探头的形状和材料：振幅与面积成反比。超声波清洗器(DL-720D)DL型系列超声波清洗器除其本身具有高效，高质量的清洗功能外，还具有“脱气”、“提取”、“乳化”、“加速溶解”、“粉碎”、“分散”等多种功能。产品广泛应用于各种需要清洗的物品。SonicsVC750/VC500超声波破碎仪适用于多种研究领域之多用途多功能的超声破碎仪，它可处理由几微升到多达几百升的有机和无机样品，能够破碎各类细胞、细菌、孢子、组织，又可以打碎聚合物，乳化样品，溶解难溶物质，加速反应，雾化液体，分散颗粒，制备样品，气化液体及清洗技术。机械法的缺点：需要高的能量并且产生高温和高的剪切力，容易使不稳定产品变性失活。产物非专一，产生微粒尺寸范围大，分离困难。二、非机械法①酶溶破碎法（enzymelysis）②化学破碎法（chemicaltreatment）③渗透压冲击破碎法（osmoticshock）④冻融破碎法（freezingandthawing）⑤干燥破碎法（drying）其中酶法和化学法应用最广。物理法①酶解酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阴性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。酶解法的优点能选择性地释放产物抽提的速率和收效高发生酶解的条件温和不残留细胞碎片但酶水解价格高，故小规模应用较广。自溶作用自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。②化学法采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来。酸碱处理，调节pH，改变蛋白质所带电荷，物质间