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第十章生殖工程—试管婴儿人工授精、试管婴儿、克隆技术生殖工程发展简史200年前，JohnHunter用注射器将一位尿道下裂的丈夫的精液注入妻子的阴道内怀孕。1953年，第一例冷冻精子人工授精成功，但人工授精技术一直到70年代才广泛应用于临床1983年，我国首个利用冷冻精子人工授精婴儿出生。1984年，美国WilliamPancoast首例报道供精人工受孕.1978年，世界第一例试管婴儿LouisBrown在英国剑桥大学诞生，开创体外授精治疗不孕新的里程碑。1988年，我国第一例试管婴儿出生第一节人工受精人工受精：收集丈夫或自愿献精者的精液，由医师注入女性生殖道以达到受孕目的的一种技术。解决男性不育的主要方法必须具备的三个条件：足够数量和活力的精子正常的排卵至少一条输卵管通畅和功能正常一、分类依据精液来源分为：夫精人工授精（AIH）：使用丈夫精子供精人工授精（AID）：自愿献精者的精子依据操作方法：子宫人工授精：宫腔内授精、宫颈内授精、阴道内授精输卵管内精液灌注：是人工授精的一种新方法二、接受人工授精妇女的条件有规则的月经周期有正常排卵输卵管必须通畅生殖器官无严重疾患三、AID供精者的选择挑选体力和智力俱佳的已婚青壮年男性仔细检查精液质量，排除一切遗传病和性传播性疾病供方与受方不相识兼顾供者血型、身高、肤色及头发颜色是否与患者丈夫一致五、人工授精治疗程序（一）精液的采集和处理逆行射精者：采精前每4小时服碳酸氢钠1克，使尿液pH值达到7.2~7.7，排空尿液，冲洗膀胱，诱导排精，取膀胱内容物，离心浓缩至1ml立即进行人工授精精液量及精子少的患者：多采集几次浓缩后进行人工授精精液不液化：授精前加糜蛋白酶或胰蛋白酶使之液化精子活力差：加入咖啡因，终浓度为7.2mmol/L,提高精子活力，提高精子受精能力。（二）人工授精的方法1、子宫人工授精①宫腔内授精：处理过的精子直接送入宫腔②宫颈内授精：将精液注入宫颈内③阴道内授精：将精液注入子宫颈周围将宫颈盖上宫颈杯，将精液注入杯中，杯留放24小时2、输卵管内精液灌注原理：封闭子宫颈口后，向宫腔内注入4ml处理过精子悬液，利用子宫腔压力，使输卵管内口张开，精液进入输卵管。第二节：试管婴儿的培育方法第一代试管婴儿：体外受精-胚胎移植术1978英国1988中国第二代试管婴儿：单精子卵细胞浆内显微注射授精技术1992比利时1996中国第三代试管婴儿：胚胎种植前的遗传学诊断19901999中国第四代试管婴儿：核移植技术1997英国2002年中国一、第一代试管婴儿技术即常规的体外授精-胚胎移植(IVF-ET)主要解决女性因素的不育。主要应用于：①双侧输卵管缺如或完全阻塞，估计治疗效果差或经治疗无效者；②行宫腔内人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④需要赠卵，并有受孕的其它基本条件者。此项技术于1976年创立于英国，世界和中国的第一例试管婴儿分别于1978年和1988年诞生。二、第二代试管婴儿技术即单精子卵细胞浆内显微注射授精技术(ISCI)。依靠显微注射系统，选择吸取单个活精子，直接注入卵母细胞内进行人工授精，主要解决男性因素的不育。主要应用于：①严重的男性因素不育(严重少精症、弱畸精症、阻塞性无精症、精子成熟障碍)；②常规的体外授精周期中，卵子不受精或受精率低下，可用该技术作为补救手段。此项技术于1992年创立于比利时，世界和中国的第一例第二代试管婴儿分别于1992年和1996年诞生。它对家畜的育种和珍稀动物的拯救也具有重要的应用价值。三、第三代试管婴儿技术即胚胎移植前的遗传学诊断技术(PGD)显微注射技术虽然提高了试管婴儿技术的成功率，但也加大了胎儿畸形的风险。在前两代技术的基础上，对植入前的胚胎进行筛选，选择健康、正常、无遗传性疾病(优生)的胚胎植入子宫内。这一技术和显微注射技术的联合运用，被称为第三代试管婴儿技术。主要适应用于：遗传性疾病、遗传高危夫妇。世界和中国的第一例第三代试管婴儿分别于1990和1999年诞生。四、第四代试管婴儿技术，即核移植技术通俗地讲，就是克隆人。但存在两个问题：操作时带入外源DNA、受体细胞线粒体遗传。另外，需要指出的是隆人已经不是传统意义上的试管婴儿，它只是男方或女方某一方的复制品，而不是精子和卵子结合的产物。随着国外克隆羊(多利)的诞生，2002年2月中国诞生了克隆牛。现在，克隆人已经不存在技术问题，存在的只是伦理道德问题。美国科学家于2001年10月首次成功克隆出早期人类胚胎，立即招来了许多抨击。目前，国际社会正准备讨论通过一项“关于禁止克隆人的国际公约”，公约将规定除非由于医治某种疾病(不孕症除外)，否则不能进行克隆人研究一、常规试管婴儿培养技术——第一代试管婴儿体外授精-胚胎移植术：体外让卵子与精子结合形成受精卵，在体外继续培养8细胞左右，再将胚胎重新移植到母亲子宫中，继续发育生长直至足月分娩。主要解决女性因素的不育。适应症：①双侧输卵管缺如或完全阻塞，估计治疗效果差或经治疗无效者；②行宫腔内人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④需要赠卵，并有受孕的其它基本条件者。一、常规试管婴儿培养技术——第一代试管婴儿体外授精-胚胎移植术：体外让卵子与精子结合形成受精卵，在体外继续培养8细胞左右，再将胚胎重新移植到母亲子宫中，继续发育生长直至足月分娩。主要解决女性因素的不育。（一）主要适应症和禁忌症：适应症：①输卵管病变所致不孕：双侧输卵管缺如或完全阻塞；②行宫腔内人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④子宫内膜异位症不孕；适应症：⑤无排卵或黄素化卵泡未破裂综合征；⑥子宫颈病变，阻碍精子进入；⑦一方生殖细胞缺如；⑧子宫发育异常或缺如；⑨选择性生育。禁忌症：①年龄：40岁以上不适于IVF；②过度肥胖者；③高催乳素血症造成的不孕；④严重的盆腔粘连者。（二）卵子的收集1、获得可受精卵的方法①自然周期法：②药物诱发超数排卵法：③诱发排卵常用药物及其作用机制克罗米酚、人绝经期促性腺激素（hMG）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）、FSH2、采卵的方法①腹腔镜手术取卵②超声波导向采卵3、卵子成熟度的判定从理论上讲，成熟的卵母细胞在排卵前已完成第一次成熟分裂，第一极体的排出是卵成熟的标志。经验性评估卵母细胞成熟度的方法①根据卵丘细胞的伸展度②依据卵泡的大小③根据卵丘细胞内脂肪颗粒多少④根据卵-放射冠-卵丘复合体的特点成熟型：直径3~5mm或更大，卵丘细胞之间距离大，放射冠分散，透明带可见。未成熟型：直径1~1.5mm，紧密放射冠，看不清透明带成熟的卵母细胞未成熟卵母细胞（三）精子的准备1、精液的采集与人工授精相同2、精液分析形态、细菌、免疫、细胞遗传学关于精子受精能力的评价：①保持直线性向前运动能力的精子受精能力强②正常精子多而畸形精子少，受精能力强③穿卵实验阳性，受精能力强3、精液的加工处理目的：洗涤精子、去除精浆、增强精子活力、精子获能穿卵实验阳性（四）体外授精及体外培养1、孵育卵细胞：使卵母细胞在体外进一步成熟2、检查精子活力，调节精子浓度3、人工授精：向孵育好的卵细胞中加入适量精子5~10万4、换液培养：人工受精后14~16h观察，如出现雌、雄原核，卵周隙有第二极体，表明受精成功，随后将受精卵转移到生长培养基中继续培养，使其卵裂并发育，以便适时施行胚胎移植。（五）胚胎移植与妊娠监护ET是试管婴儿试验中的最后一步，也是最重要一关1、胚胎的移植：2~16细胞（卵裂球）时移植；2~4胚胎/次2、妊娠监护：放射免疫方法检测血、尿中hCG6天：血中hCG升高，8天：尿中hCG升高3周：超声检查胚囊位置，5周：胚胎大小和胎心波动3、影响ET的因素：①移植时，母体子宫内膜与胚泡发育不同步；②穿刺取卵时黄体受损，使黄体功能不足；③移植过程中，胚泡损伤或子宫内膜损伤4、提高受精率，卵裂率，早期胚胎率关键在于不断提高体外配子及胚胎培养技术共培养技术提高受精卵、胚胎质量及妊娠率。共培养：指卵子和精子体外受精后，置于一定浓度共培养细胞的条件培养基中共同培养。共培养细胞：自体细胞或异体细胞子宫内膜细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞（六）“试管婴儿”的成功率1、成功率：体外受精率：85%~90%卵裂率（体外培养成功率）：80%胚胎移植后妊娠率：20%~25%2、畸形发生率：1987~1991年总计出生6248例试管婴儿，有某种畸形的新生儿187例，占总数的2.8%。这与自然妊娠分娩的新生儿畸形发生率相当。二、显微授精——第二代试管婴儿主要目标：帮助精子穿过透明带显微授精技术透明带钻孔技术（PZD）透明带下授精（SUZI）卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）针对男性少、弱、畸精症或阻塞性无精症（一）显微授精技术发展简史1962年Hiramoto首次将海胆精子直接注入海胆卵中1966年Graham将青蛙精子注入未受精的蛙卵中，PN形成1988年第一个通过精子微注射受精的子代动物（小鼠）诞生1988年lanzendorf等人首次报道人精子直接注入卵胞浆中PN形成1992年Palermo等人报道卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）婴儿诞生1996年我国首例ICSI在中山医科大学获得成功（庄广伦）（二）IntracytoplasmicSpermInjection(ICSI)定义：指用显微操作术将单个精子注入卵胞浆的过程适应症：①严重精子质量异常②既往常规IVF失败患者③严重的抗精子抗体患者④无精子症患者⑤未成熟卵以及冷冻保存的卵母细胞⑥常规IVF失败未受精卵母细胞ICSI操作程序促排卵和卵子的采集卵子体外培养精子的采集及处理显微注射①精子制动②卵胞浆内精子注入③放开卵母细胞，培养16~24h4~8-细胞或囊胚后，移植母体子宫中影响ICSI成功的主要因素ICSI成功与否主要看受精、卵裂及妊娠率，除技术因素外，径自、卵子状态及卵子激活等都直接影响其成功。①显微操作技术对ICSI的影响体外操作过程不超过5分钟注射针内径5~8微米之间固定针外径120微米，内径15~40微米②精子状态对ICSI的影响影响ICSI成功的主要因素③卵子对ICSI的影响卵子状态卵母细胞成熟程度女性年龄影响卵子质量卵子激活以放出第二极体、形成雌雄原核为标志并最终启动卵子代谢的一系列变化ICSI的风险与出生缺陷与ICSI操作无关卵巢过度刺激综合征、多胎妊娠、异位妊娠与ICSI操作有关基因缺陷垂直传播外源DNA污染三、细胞核移植技术----第四代试管婴儿（一）、概论什么是克隆？“clone”：单性生殖，本意是指通过无性形式由单个细胞产生的和亲代非常相似的后代。动物克隆：指一个动物经无性繁殖或孤雌生殖而产生的多个后代，克隆的所有成员遗传物质完全相同。人有无自然单性生殖？古代传说：轩辕黄帝之母“感电光绕头而有娠”，生黄帝1955年，Spuwary,相信人类有单性生殖至今尚无一例经得起严格的科学检验生物进化证明：有性生殖是从无性生殖发展而来，刻意对人进行无性生殖意味着退化！细胞核移植是指将发育不同时期的胚胎或成体细胞核经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，或将体细胞核直接注入去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成子代个体。克隆技术之所以引人关注，是因为它在医疗和畜牧业方面有深远意义克隆研究大事记1938年，德国科学家Spemann首次提出动物细胞克隆设想1952年，美国学者Briggs和King首先在青蛙身上进行克隆实验1970年，克隆青蛙取得突破进展1981年，胚胎克隆鼠成功1984年，胚胎克隆羊成功克隆研究大事记1994年，用发育120个细胞阶段的胚胎细胞核移植成功，获得克隆牛1997年，英国Wilmut体细胞克隆羊成功“多莉”1998年，英国PPL医疗公司，克隆牛“弗逊先生”1998年，克隆鼠克隆出克隆鼠1999年，美国克隆第一只雄性鼠2000年，美国牛耳皮细胞克隆6头牛2001年，美国克隆出第一个灵长类动物恒河猴二、哺乳动物细胞核移植方法（一）重构卵的形成1、供体细胞和受体细胞的选择和处理供体细胞：即细胞核的来源早期胚胎细胞、干细胞、体细胞受体细胞：提供去除核后的只含有细胞质的细胞MII期卵母细胞、受精卵、融合后