第十章+核酸的生物合成.

第十章核酸的生物合成1944年，Avery等人的实验证明DNA为遗传物质Watson&Crick的双螺旋模型展示了一种可能的方式——半保留复制。遗传物质的基本特征是能进行复制半保留复制（semiconservativereplication）：在DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先行解旋和分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，在这两条链上各形成一条互补链。这样，从亲代DNA的分子可以精确地复制成2个子代DNA分子。每个子代DNA分子中，有一条链是从亲代DNA来的，另一条则是新形成的。DNA的生物合成机制——半保留复制1957年Meselson及Stahl通过实验证实了半保留复制的模式。半保留复制的实验证据1963年，Cairns用放射自显影的方式观察到大肠杆菌正在复制中的DNA，在用氚标记的胸苷复制近两代，放射自显影，未复制部分银密度低，由一条放射链和一条非放射链组成；已复制部分有一条双链是放射的，一条双链有一半是放射的。这证明大肠杆菌DNA是环状分子，以半保留方式复制。半保留复制的实验证据1956年，ArthurKornberg首先从大肠杆菌中发现DNA聚合酶（DNA聚合酶Ⅰ）。70－71年分离出Ⅱ和Ⅲ。1999年发现Ⅳ、Ⅴ，涉及错误倾向修复DNA聚合酶及其发现以四种dNTP为底物需要模板指导需要有引物3’-羟基存在DNA链的生长方向是5’→3’产物DNA的性质与模板相同DNA聚合酶的反应特点大肠杆菌DNA聚合酶小片段/323aa5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段/604aa5´→3´聚合/5核酸外切N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段真核生物DNA聚合酶有α、β、γ（线粒体）、δ、ε五种核DNA的复制主要由α、δ完成；α最初认为相当于聚合酶Ⅲ，现认为主要用于引发（因为无校正功能，仅其有引发功能）；δ能持续合成，且有校正功能。ε相当于Ⅰ，主要起修复作用，γ位于线粒体，β为修复酶。DNA连接酶DNA连接酶使双链DNA切口处的5’-磷酸和3’-羟基生成磷酸二酯键。需供能，细菌用NAD，动物和噬菌体用ATP，形成焦磷酸键的活化形式，再由3’羟基发动亲核攻击，形成磷酸二酯键。大肠杆菌的连接酶作用于粘末端，T4的还可作用于平末端。DNA的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物的聚合反应，该过程除了需要酶的催化之外，还需要适量的DNA为模板，RNA（或DNA）为引物和镁离子的参与。催化这个反应的酶也有多种，除DNA聚合酶外，还有RNA引物合成酶（即引发酶），DNA连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及单链结合蛋白多种蛋白质因子参与。DNA复制有关的酶及相关蛋白因子DNA的复制拓扑异构酶拓扑异构酶Ⅰ:切断DNA双链中一股链，封闭切口，反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ:切断DNA分子两股链，利用ATP供能，连接断端。DNA的复制过程——复制的起始复制的起始点：从DNA分子的特定部位开始，此特定部位称为复制起始点（originofreplication），可以用ori表示。原核生物常只有一个起始点，E.Coli的起点为OriC，由245个bp组成（p421），非常保守。真核生物的染色体有多个复制起始点。）DNA甲基化与DNA复制起始密切相关DNA子链被合成后，起点处子链GATC（11个）较长时间保持未甲基化。半甲基化的oriC与细胞原生质膜相结合。只有当oriC被从膜上释放出来，子链被Dam甲基化后，才能有效地与DnaA蛋白结合，起始新一轮的DNA复制。DNA拓扑异构酶Ⅱ在复制起始部位将DNA引入负超螺旋。DnaA蛋白辨认、结合于起始位点，并促使解链。DnaB与DnaC复合物进入，生成引发前体，然后DnaB继续发挥解链的作用。SSB与解开的单链结合，稳定和保护单链。引物酶(DnaG)进入并与引发前体结合生成引发体（DnaB、DnaC蛋白、引物酶和DNA起始区）。引发体中的引物酶催化NTP聚合，生成引物。DNA拓扑异构酶(Ⅱ型为主)在解链前方理顺DNA链，松弛正超螺旋。原核生物DNA复制的起始DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB3535复制的引发——形成引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。DNA的复制起始过程说明复制的方向：一般为双向复制。合成的开始与甲基化有关，由甲基化酶Dnm完成起始相关蛋白，DnaA、DnaB、DnaC、DnaG等复制时需要解螺旋酶和拓扑异构酶来解链的。单链结合蛋白(SSB)可与解开的单链结合，防止复性和水解复制有一些特殊方式。复制叉、滞后链、冈崎片段与不连续复制复制叉由5’向3’方向连续复制，称为前导链；另一条链复制叉由3’向5’移动，称为滞后链。滞后链的复制中，形成许多不连续片段，称为冈崎(Okazaki)片段。冈崎片段连接成完整的DNA引物合成酶由5’向3’方向合成RNA引物聚合酶Ⅲ在引物3’-羟基上合成DNA聚合酶Ⅰ切除引物，填补空白DNA连接酶将冈崎片段连接起来向导链滞后链冈崎片段5′5′3′3′5’3’DNA的复制过程：半保留的半不连续复制其他DNA复制模式滚环复制D环复制（线粒体DNA)端粒和端粒酶的发现30年代，Muller等发现对保持染色体稳定十分重要的染色体末端结构—端粒。1972年JamesWatson提出复制末端问题。1984年，Blackburn发现草履虫（无限增殖）具有重建端粒的酶——端粒酶。端粒端粒是真核生物线性染色体的两个末端所具有的特殊结构,其由许多成串的短的重复序列组成。功能：维持染色体的稳定性；保证染色体末端DNA复制的完整性TTAGGGTTAGGG…端粒酶(telomerase)端粒酶由RNA和蛋白质组成。兼有模板和逆转录酶两方面的作用多莉与细胞的死亡爬行模型动画演示PCR——多聚酶链式反应聚合链式反应（PolymeraseChainReaction），K.Mullis1985年发明。是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，又称为基因的体外扩增法。PCR技术的原理与细胞内发生的DNA复制过程十分类似。1993年获得诺贝尔奖PCR主要包括三个阶段变性DNA在高温94℃变性，形成两条单链。退火反应体系降温至50-60℃，模板DNA与引物结合。延伸反应体系升温至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的指导下，复制出互补的DNA。一种PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200μmol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100μl94℃，预变性5分钟94℃，变性1分钟55℃，退火1分钟72℃，延伸1分钟最后一次72℃，延伸5分钟30个循环一种PCR反应程序设计生物因素、物化因素均可导致DNA的损伤1.物理因素紫外线、电离辐射、αβγX-射线等2.化学因素烷化剂、碱基或核苷类似物、亚硝酸盐及亚硝胺、代谢活化化合物（苯并笓、黄曲霉毒素等）以上物理及化学因素统称诱变剂。3.生物因素DNA、RNA肿瘤病毒可插入基因组，引起突变。复制时的碱基错配，互变异构、碱基脱氨、碱基丢失。DNA的损伤修复主要有五种修复系统：错配复活（mismatchrepair)直接修复（directrepair)切除修复（excisionrepair）重组修复（recombinationrepair）易错修复（error-pronerepair）错配复活(MismatchRepair)原核细胞内存在Dam甲基化酶，能使5`GATC中A的N6位甲基化。复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列。细胞错配系统能区别新链与旧链。MutS二聚体与其识别结合，两向移动形成突环至GATC。核酸内切酶（MutH）从未甲基化的GATC5’端开切，重新合成（DNA聚合酶）直接修复（DirectRepair)光复活酶可被可见光激活，分解UV照射形成的嘧啶二聚体。O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶能去除O6上的甲基，恢复正常的鸟嘌呤。UVO6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶去除O6上的甲基切除修复（ExcisionRepair）是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。多种特异的核酸内切酶，识别DNA损伤部位，在其附近将DNA单链切开，再由外切酶将损伤链切除，由聚合酶以完整链为模板进行修复合成，最后有连接酶封口。重组修复——稀释错误此过程也叫复制后修复。重组修复中原损伤没有除去，若干代后可逐渐稀释。所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶。易错修复（Error-ProneRepair）SOS反应：是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急效应。紫外线照射过的E.Coli较未照射过的E.Coli，接受紫外线照射过的λ噬菌体感染时存活率高。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错修复(errorfreerepair)和易产生差错修复.逆转录（ReverseTranscription)以RNA为模板,指导DNA合成的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。1964年Temin提出前病毒假设。1970年Temin和Baltimore同时分别从(鸡)劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致癌RNA病毒中分离出反转录酶1975年，二人获得诺贝尔奖RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA逆转录病毒的复制逆转录酶的酶学性质逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：RNA指导的DNA聚合酶活性DNA指导的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA。转录（transcription）生物体以DNA为模板合成RNA的过程不对称转录：DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板。原料：四种NTP合成过程:无需引物，连续，方向：5‘→3’从头合成不对称转录指导RNA合成的DNA链为模板链（负链，反意链），另一条DNA链为编码链（正链，有意义链）DNA链上只有部分的区段作为转录模板，且模板链并非自始至终位于同一股DNA单链上5′···GCAGTACATGTC···3′编码链3′···CGTCATGTACAG···5′模板链5′···GCAGUACAUGUC···3′mRNAN······Ala·Val·His·Val······C蛋白质转录翻译1960年发现。全酶：α2ββ’σ，其中α2ββ’为核心酶，σ因子识别转录起始位点。5’→3’聚合活性，无外切酶活性合成起始不需引物RNA聚合酶（E.coli）原核生物的转录起始起始包括对双链DNA特定部位的识别、局部（17bp）解链以及在最初两个核苷酸间形成磷酸二酯键。第一个核苷酸掺入的位置称为转录起点。σ识别起始位点，RNApol全酶解开双链DNA10～20bp形成转录空泡。在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。E.coli的启动子(promoter)启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。足迹法和DNA测序确定启动子序列结构。开始转录TTGACAAACTGT-35区PribnowboxTATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205335－35序列55RNA聚合酶保护区结构基因33原核生物启动子结构－35序列，提供RNA聚合酶识别的信号，pribnowbox，有助于局部解链原核生物转录的延伸过程σ因子脱落，核心酶变构，与模板链结合变松，沿DNA滑动。转录泡随核心酶滑动而移动，生成的RNA与DNA模板形成约12bp杂化双链，过长的RNA脱离模板链，伸出转录泡外原核生物转录的终止提供终止信号的DNA序列，称为终止子核心酶识别终止信号，停止转录。两类终止子：依赖和不依赖ρ因子的终止子顺式作用元件（cis