补肾健脾方促卵泡发育及排卵的实验研究

1补肾健脾方促卵泡发育及排卵的实验研究王希浩1，李兴华2（1.河南省中医药研究院，河南郑州450008；2.河南中医学院，2007级研究生，河南郑州450008）摘要目的：探讨补肾健脾方促进卵泡发育及排卵的作用机理。方法：以未成年雌性大鼠为研究对象，对其阴道脱落细胞、子宫卵巢形态学、血清前列腺素等指标进行观察比较。结果：补肾健脾方能促进卵泡发育及排卵，促进子宫内膜向分泌期转变，并能调节血清前列腺素。结论：补肾健脾方促卵泡发育及排卵的机制可能与调节H-P-O,调节前列腺素有关。通过促排卵，促进子宫内膜向分泌期转变，从而达到止血的目的。关键词：补肾健脾方；促卵泡发育及排卵；青春期功血；实验研究近年来随着求学压力的增加，青春期功血的发病率逐年上升，约占功血的4％，其中无排卵及黄体形成者占55%一75%[1]，目前是妇科的疑难病症之一。导师以补肾健脾，固冲止血为治则，拟补肾健脾方治疗青春期功血取得了良好的临床疗效。本实验旨在探讨其促卵泡发育及排卵的作用机理。1材料与方法1.1实验动物雌性未成年Wistar大鼠66只,25~28日龄,体重60～80g,由河南省实验动物中心提供，合格证号：scxk(豫)2005-0001。1.2实验药物补肾健脾方由党参、炒白术、荆芥炭、生山药、川断、阿胶等组成。按原方剂量20倍取材制剂，所得制剂含生药浓度约1.5g/ml，宫血停颗粒：10g/袋，哈药集团中药三厂生产，批号：080351。已烯雌酚片：0.5mg/片，合肥久联制药有限公司生产，批号：20070914，均按照临床剂量的6.7倍制成，置于4℃冰箱备用。由河南省中医药研究院制剂室提供。1.3主要仪器及试剂生物显微镜：OLYMPUS859310JAPAN。血球分类计数器：由福建罗源医械二厂生产。智能放免r测量仪:由上海原子核研究所日环仪器厂生产。大容量低速冷冻离心机：由上海中科生物医学有限公司生产。血栓烷B2、6-酮-前列腺素F1α放免试剂盒：均由解放军总医院科技开发中心放免研究所提供，批号：200902274。21.4动物分组及给药方法选取健康未成年雌性大鼠66只,随机分为补肾健脾方高、中、低剂量组、宫血停组、已烯雌酚组和空白对照组,每组13只,分笼喂养,每日定时灌胃,给药1次。中药高、中、低剂量组给药剂量分别为30g/kg、15g/kg、7.5g/kg（以生药量计），分别相当于临床剂量的6.7倍、3.35倍、1.68倍。阳性对照组分别给予宫血停、已烯雌酚,均按临床剂量的6.7倍制成，用药剂量分别为8g/kg、0.067mg/kg，各组用药体积均为20ml/kg,空白对照组给予等量生理盐水。均连续给药22d。1.5检测指标与方法1.5.1阴道脱落细胞变化于给药的第17天起，每日上午进行阴道脱落细胞涂片1次，连续1个性周期（5天）。方法：将蘸过生理盐水的棉签插入大鼠阴道约3－4mm，轻轻旋转一周取出，涂于载玻片上，晾干，用95％无水乙醇固定约3－5分钟，HE染色，用200倍生物显微镜观察。通过阴道脱落细胞检测来判断大鼠动情周期变化。1.5.2子宫卵巢组织形态学观察动物处死同时摘除双侧卵巢、子宫。将分离的卵巢子宫固定于10％多聚甲醛液中,然后脱水，石蜡包埋，切片，常规HE染色，观察比较子宫卵巢组织形态学变化（包括各级卵泡数目、黄体数目、主卵泡直径及卵泡成熟总数）。卵泡直径以切片中最大卵泡直径计；卵泡成熟总数以每只大鼠单侧卵巢切片中黄体数与成熟卵泡数相加之和计。1.5.3血清6-酮-PGF1a和TXB2测定于给药22天后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血2-3mL，离心分离血清。用放射免疫分析法测定6-酮-PGF1a和TXB2，严格按照试剂盒说明书操作。3统计分析所有数据均采用Spssforwindows(ver13.0)软件进行统计处理，组间两两比较用t检验，结果以均数（x）±标准差(S)表示。4结果4.1阴道脱落细胞检查空白对照组大鼠阴道涂片表现混乱,多数持续在动情间期，无周期性变化;3补肾健脾方组大鼠则部分已表现出周期性，但尚不稳定。空白对照组涂片可见大量底、中层细胞，表层细胞较少，角化细胞所占比例小；补肾健脾方组、宫血停组涂片可见少量底层细胞，中、表层细胞多见，角化细胞所占比例较大；乙烯雌酚组涂片可见大量中表层细胞，角化细胞所占比例大。4.2各组大鼠子宫卵巢组织形态学变化4.2.1子宫组织形态学肉眼观察:己烯雌酚组子宫轻度充血，明显增粗。余组无明显差别。镜下观察：空白对照组子宫壁较薄，粘膜较薄，固有层结缔组织较致密，腺体较少，腺腔小，上皮细胞呈柱状，排列紧密,无明显的分泌现象；补肾健脾方高、中、低剂量组及宫血停组子宫内膜多呈分泌期改变，表现为子宫内膜增厚,腺体数目增多，腺腔扩大，上皮细胞矮柱状排列，可见核上或核下空泡态；己烯雌酚组子宫内膜增生相明显，表现为子宫内膜明显增厚，腺体增多、变大，上皮细胞高柱状排列。（见附录1图1-6）4.2.2卵巢组织形态学肉眼观察：己烯雌酚组卵巢略大，颜色略深，其余各组无明显差别。镜下观察：空白对照组可见较多原始卵泡、初级和次级卵泡，成熟卵泡较少见，偶见黄体。宫血停组可见各级卵泡，成熟卵泡略增，黄体增多。补肾健脾方低剂量组与空白组相似。补肾健脾方高、中剂量组可见各级卵泡，成熟卵泡略增，黄体明显增多。己烯雌酚组可见各级卵泡，初、次级卵泡、成熟卵泡明显增多，但少见黄体，颗粒细胞层明显增厚。（见附录2图1-6）表1各组大鼠原始卵泡、初次级卵泡、卵泡直径比较（x±S）组别动物数(只)剂量(g/kg)原始卵泡（个）初次级卵泡（个）主卵泡直径（µm）空白对照组11－2.88±0.766.21±1.77363.52±71.82己烯雌酚组110.0672.36±0.5712.24±3.11**378.12±91.49宫血停组118.02.64±0.818.82±2.65﹡407.97±90.18高剂量组1130.02.33±0.669.06±2.87﹡423.75±61.52﹡中剂量组1115.02.48±0.788.45±3.73419.15±47.43﹡低剂量组117.52.67±0.706.91±3.12402.69±93.11注：与空白对照组比较，﹡P0.05,**P0.01。由表1可知，与空白对照组比较，各给药组原始卵泡数均有下降趋势，但无统计学意义(P0.05)；补肾健脾方高剂量组、宫血停组、己烯雌酚组初次级卵泡4数明显增加(P0.05,P0.01)；补肾健脾方高、中剂量组主卵泡直径明显增大(P0.05)。表2各组大鼠成熟卵泡数、黄体数、卵泡成熟总数比较（x±S）组别动物数(只)剂量(g/kg)成熟卵泡数（个）黄体数（个）卵泡成熟总数(个）空白对照组11－2.91±0.753.30±1.026.21±1.40己烯雌酚组110.0674.03±1.32﹡2.69±0.606.73±1.55宫血停组118.03.12±1.194.64±1.997.67±1.88﹡高剂量组1130.03.46±1.945.21±1.64**8.67±2.49**中剂量组1115.03.48±1.474.60±1.79﹡8.09±2.28﹡低剂量组117.53.06±1.544.18±0.977.24±2.04注：与空白对照组比，﹡P0.05,**P0.01。由表2可知，与空白对照组比较，己烯雌酚组成熟卵泡数明显升高(P0.05)，其他给药组亦有上升趋势(P0.05)；补肾健脾方高、中剂量组黄体数明显升高(P0.05,P0.01)，己烯雌酚组略有下降(P0.05)；补肾健脾方高、中剂量组、宫血停组卵泡成熟总数明显升高(P0.01,P0.05),低剂量组和己烯雌酚组亦有升高趋势(P0.05)。2对大鼠血清6-酮-PGF1α和TXB2的影响表3不同给药组对大鼠血清6-酮-PGF1α和TXB2的影响（x±S）组别数量(只)剂量(g/kg)6-酮-PGF1α（pg/ml）TXB2（ng/ml）TXB2/6-酮-PGF1α空白对照组11--2318.76±513.61663.63±49.113.48±0.69己烯雌酚组110.0672812.32±245.11**758.69±37.45**3.70±0.21宫血停组118.02672.89±117.19﹡661.47±89.714.11±0.63﹡高剂量组1130.02717.56±205.87﹡669.09±62.254.09±0.42﹡中剂量组1115.02689.95±229.89﹡663.38±35.344.06±0.34﹡低剂量组117.52649.26±376.42683.83±43.633.88±0.56注：与空白对照组比较，﹡P0.05,**P0.01。由表3可知，与空白对照组比较，补肾健脾方高剂量组、中剂量组、宫血停组、己烯雌酚组血清6-酮-PGF1α含量均明显升高(P0.05，P0.01)；己烯雌酚组血清TXB2含量显著升高(P0.01)，其余给药组差异无显著性(P0.05)；补肾健脾方高、中剂量组，宫血停组6-酮-PGF1α/TXB2值均明显升高(P0.05)。55讨论5.1中医对青春期功血的认识青春期功能失调性子宫出血，简称青春期功血，又称室女崩漏，属于祖国医学崩漏范畴。中医学认为月经的产生是在肾气盛、天癸至的前提下，任通冲盛，脏腑、经络、气血共同作用于胞宫，使之藏泻有序，经水如期而至。导师认为青春期少女肾气逐渐旺盛，精气血日趋充盈，天癸始泌，全身脏腑功能逐渐成熟。青春期功血的发生是由于肾-天癸-冲任-胞宫性腺轴尚未成熟，在内外因素的作用下，易使肾气虚弱，封藏失职，冲任不固，而发为功血。青春期崩漏病本在肾，病位在冲任、子宫，表现为胞宫藏泻失常。本病日久可导致阴血亏虚，肝气偏旺。故以补肾健脾、固冲止血为治则拟定补肾健脾方。其中熟地、山萸肉、阿胶补肾益精，固冲任，收敛止血；党参、炒白术等益气养阴，健脾摄血，后天养先天；生白芍养血柔肝；旱莲草、荆芥炭等入血分而止血。诸药合用，共奏补肾健脾，固冲止血之效。本方塞流、澄源并用，固标与治本结合，固摄中又兼顾到活，使血止而不留瘀。5.2补肾健脾方能促进卵泡发育及排卵5.2.1补肾健脾方对卵巢组织形态学的影响青春期功血多属无排卵性功血，主要是由于青春期下丘脑周期调节中枢发育不成熟，H-P-O轴之间尚未建立稳定完善的周期调节和反馈机制，特别是正反馈机制，成批卵泡发育至一定阶段即闭锁，而无排卵，从而引起子宫异常出血。故本病的主要问题是H-P-O轴功能不调所致的不排卵。卵巢组织形态学显示：与空白对照组比较,补肾健脾方组能使初次级卵泡数显著增加，主卵泡直径明显增大，黄体数明显升高，卵泡成熟总数明显升高。结果表明补肾健脾方具有促进各级卵泡发育，促进排卵及黄体形成的作用。据现代药理学研究，补肾药能提高垂体对下丘脑的反应，改善内分泌调节功能，改善低雌激素环境，促卵泡发育成熟，亦可改善机体的免疫功能[2]。其他相关实验表明补肾健脾方具有促进性腺轴成熟，调节内分泌的作用。本实验证实了补肾健脾方具有促进各级卵泡发育，促进排卵及黄体形成的作用，提示其作用机制可能是通过促进下丘脑-垂体-卵巢轴成熟，调节内分泌来实现的。5.2.2补肾健脾方对子宫组织形态学的影响6子宫内膜是卵巢性激素作用的靶器官，在卵巢分泌的雌孕激素作用下发生周期性变化，分为增生期、分泌期、月经期。增生期子宫内膜在雌激素的作用下，子宫内膜逐渐增厚，腺体数增多，增长，管腔增大。排卵后形成黄体，分泌雌孕激素，使子宫内膜由增生期转化为分泌期。正常月经的发生是基于排卵后黄体的萎缩,雌激素和孕酮的撤退,使子宫内膜皱缩坏死而脱落出血。青春期功血多属无排卵性功血，是由于子宫内膜受单一雌激素刺激而无孕酮对抗而引起的雌激素撤退出血或雌激素突破出血[3]。子宫组织形态学显示：与空白对照组比，补肾健脾方组子宫内膜多呈分泌期改变，表现为子宫内膜增厚,腺体数目增多，腺腔扩大，上皮细胞矮柱状排列，可见核上或核下空泡态。表明该方具有调节卵巢性激素，促进子宫内膜由增生