第四章+微生物的生长.

第四章微生物的生长学习目的与要求掌微生物的生长曲线及其各个阶段的意义。熟记环境因素对微生物生长繁殖的影响。熟悉有害微生物的控制方法生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。由于微生物个体微小，因此在描述微生物的生长时，一般是指其群体生长。个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖第一节微生物的生长繁殖多数微生物，尤其是单细胞微生物，其个体生长难以观察和测量，人们肉眼所见往往是微生物的群体，因此在研究微生物生长规律时，一般是研究其群体生长。一、细菌的生长繁殖1.影响细菌生长繁殖的主要因素（1）营养基质（2）温度：多数细菌最适生长温度20℃-40℃（3）酸碱度：多数细菌最适pH为6.5-7.5（4）渗透压（5）呼吸环境2.微生物群体的生长规律（典型生长曲线）定量描述液体培养基中细菌群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线。将少量单细胞纯种微生物，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测细菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作：接种适温培养定时取样测定生长量一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期活菌数培养时间Ⅱ.对数期Ⅲ.稳定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.迟缓期细菌数目（个/ml）对数ⅡⅢⅣⅠ细菌的生长曲线⑴迟缓期将少量细菌接种于新鲜液体培养基后，在开始的一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。又称为延滞期、适应期等。迟缓期的特点：细胞形态变大或增长，如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末细菌的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细胞体积最大；细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃；对外界不良环境条件反应敏感。迟缓期出现的原因：代谢调整菌种：繁殖速度较快的菌种迟缓期一般较短接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其迟缓期较短，甚至检查不到延滞期接种量：一般接种量增大可缩短甚至消除迟缓期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上生长的迟缓期比在合成培养基上生长时短；★影响迟缓期长短的因素：⑵对数期又称为指数期，指细菌经过迟缓期的调整后，细胞数量呈几何级数快速增加的一段时期。对数期的特点：细胞快速分裂，生长速率常数最大，细胞每分裂一次所需的世代时间最短而稳定；菌体平衡生长，个体形态、化学组成和生理特征均匀一致；酶活力高而稳定，代谢旺盛。在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的，即20→21→22→23……2n这里的指数n为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌繁殖n代产生2n个细菌。如果在对数期开始时间t1的菌数为x1，繁殖n代后到对数期后期t2的菌数为x2，则代时(Generationtime，G)（即每增加一代所需要的时间）G=（t2-t1）/n先求代数n由于x2=x1·2nlgx2=lgx1+nlg2；n=（lgx2-lgx1）/lg2n=3.3·lg(x2/x1)G=（t2-t1）/3.3·lg(x2/x1)不同种类的细菌，对数期的代时差异很大，但是多数细菌的代时为20~30min，培养基成分和环境条件对代时影响较大。应用意义：①由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度；③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期；④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。⑶稳定期又称恒定期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向零。•在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按指数期的高速率无限生长呢?•这是由于指数期细菌活跃生长引起周围环境条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。稳定期的特点：生长速率常数为零，活菌数达到平衡，菌体产量达到最高；细胞代谢活力减退，出现形态和生理特征的改变；细胞内开始积累贮藏物质；芽孢细菌此时开始形成芽孢；许多重要发酵产物在此期大量积累并达到高峰。稳定期是发酵生产收获的重要时期，延长稳定期可获得更多的代谢产物，此期是产物的最佳收获期。⑷衰亡期营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，使得细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。这一阶段的细胞，有的开始自溶，有的产生或释放出一些次生代谢产物，芽孢菌此时开始释放芽孢。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。注意：在实际工作中常采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。在实践中，应当根据什么来指导发酵工业的生产？如，何时能够收获微生物的菌体？何时适合进行代谢产物的收获？应当根据微生物群体的生长规律来指导发酵生产二、真菌的生长繁殖1.真菌生长繁殖的条件（1）营养基质：真菌对营养要求不高，一般只需供给碳源和氮源即可；（2）温度：多数真菌最适生长温度为25-30℃；（3）湿度：相对湿度在90%以上，利于真菌繁殖；（4）pH：真菌喜酸性环境，一般pH3-6之间生长良好；（5）呼吸环境：霉菌一般为好氧菌，酵母为兼性厌氧菌。丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。可分为三个阶段：1、生长迟缓期2、迅速生长期3、衰退期1.丝状真菌的群体生长规律（非典型生长曲线）1、生长迟缓期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。三、微生物的同步培养在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不完全一样。如果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长或生理特性是不符合客观实际的，然而利用单个细胞进行研究又是很困难的。为了解决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。同步培养法：使培养的微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养方法。同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步生长的细菌，其生长曲线呈现“梯形”。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。获得同步生长的方法：化学诱导物理诱导诱导法过滤法区带密度梯度离心法膜洗脱法筛选法同步培养法获得同步生长的方法主要有两类：①环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等，造成与正常细胞周期不同的周期变化。②选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。选择法又称机械法微生物的子细胞与成熟细胞，通过机械法就可使它们在一定程度上分开来。然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。离心沉降分离法过滤分离法硝酸纤维薄膜法原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。机械法同步培养物是在不影响细菌代谢的情况下获得的，因而菌体的生命活动必然较为正常。局限性：有些微生物即使在相同的发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，这样的微生物不宜采用这类方法。调整生理条件的同步法（诱导法）温度调整法将微生物的培养温度控制在亚适温度条件下一段时间，使细胞的生长在分裂前不久的阶段稍微受到抑制，然后将培养温度提高或降低到最适生长温度，大多数细胞就会进行同步分裂。营养条件调整法即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限制碳源或其他营养物，使细胞只能一次分裂而不能继续生长，从而获得了刚分裂的细胞群体，然后再转入适宜的培养基中，它们例进入了同步生长。注意：由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2-3个世代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化。四、微生物的连续培养分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuousculture）：在微生物培养的过程中，不断供给新鲜的营养液，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期。连续培养理论基础：基于对典型生长曲线中稳定期形成原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出连续培养技术。原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养恒浊法恒化法单批培养连续培养时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养连续培养控制连续培养的方法恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定的流速连续培养技术——恒浊培养概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。采用光电装置检测培养容器中的浊度，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长；但工艺复杂，烦琐。使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。连续培养技术——恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定并保持细菌生长速率恒定，使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究恒化连续培养装置装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度无限制生长因子不恒定最高大量菌体或与菌体形成相平行的产物生产为主恒化器培养基流速有限制生长因子恒定低于最高一定量的菌体实验室为主恒浊器恒化器的比较连续发酵（continuousfermentation）的特点连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：缺点：连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月。缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定。杂菌污染菌种退化营养物利用率低于单批培养第二节环境因素对微生物生长的影响环境条件适宜：微生物正常生长繁殖与代谢环境条件不宜：微生物生长繁殖受抑制甚至死亡学习环境因素对微生物生长的影响，有利于我们通过控制环境条件促进有益菌繁殖与代谢，抑制有害菌对食品等的污染。一、物理因素对微生物生长的影响1.温度温度对微生物代谢的影响主要有：影响酶活性，一定范围内，温度每升高10℃，酶促反应速率增加一倍；影响细胞膜流动性，温度高，流动性大，利于物质运输，反之流动性小，不利于物质运输；影响物质溶解度，温度高，溶解度上升，温度低，溶解度