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第四章发酵工程制药技术——微生物制药技术概述发酵的定义：利用微生物细胞中酶的作用…发酵工程制药技术又称为微生物制药技术微生物发酵制药:是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括:微生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工艺等。研究范围:微生物菌体发酵、微生物酶发酵、微生物代谢产物发酵、微生物转化发酵微生物菌体发酵：即以获得具有药用菌体为目的发酵。如：帮助消化的酵母菌片和具有整肠作用的乳酸菌制剂等；药用真菌，如香菇类、灵芝、金针菇、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌以及与天麻共生的密环菌等药用真菌；一些具有致病能力的微生物菌体，经发酵培养，再减毒或灭活后，可以制成用于自动免疫的生物制品。微生物酶发酵：目前许多医药用酶制剂是通过微生物发酵制得的，如用于抗癌的天冬酰胺酶和用于治疗血栓的纳豆激酶和链激酶等。微生物代谢产物发酵：微生物在其生产和代谢的过程中，产生的各种初级代谢产物和次级代谢产物中许多是可以用于制作药物的。如初级代谢产物：氨基酸、蛋白质、核苷酸、类脂、糖类以及维生素等；次级代谢产物：抗生素、生物碱、细菌素等。微生物转化发酵：微生物的转化就是利用微生物细胞中的一种酶或多种酶将一种化合物转变成结构相关的另一种产物的生化反应。包括脱氢反应、氧化反应(羟基化反应)、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等，这些转化反应特异性强，反应条件温和，对环境无污染，微生物转化制药最突出的例子则是甾族化合物的转化和抗生素的生物转化等。基因工程菌发酵：近年来，随着生物工程的发展，尤其是基因工程和细胞工程技术的发展，使得发酵制药所用的微生物菌种不仅仅局限在天然微生物的范围内，已建立起了新型的工程菌株，以生产天然菌株所不能产生或产量很低的生理活性物质，拓宽了微生物制药的研究范围。第一节微生物细胞的培养概述工业生产常用微生物当前发酵工业所用菌种的总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢控制育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的微生物。1、细菌细菌是自然界中分布最广、数量最多的一类微生物。发酵工业生产中常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌和短杆菌等。主要用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等。工业生产常用微生物工业生产常用微生物2、放线菌放线菌因其菌落呈放射状而得名，在自然界中分布很广。目前，工业发酵生产中主要采用放线菌生产各种抗生素，如：链霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素等。从微生物中发现的抗生素有60%以上是由放线菌产生的。3、霉菌霉菌在自然界中分布很广，发酵工业常用的霉菌有：根霉、毛霉、曲霉、青霉等，主要用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。工业生产常用微生物4、酵母菌酵母菌为单细胞真核生物，在自然界中普遍存在。发酵工业常用的酵母菌有：酿酒酵母、假丝酵母和类酵母等，主要用于酿酒、制造面包、制造低凝固点石油和生产脂肪酶，以及生产可食用、药用和饲料用的酵母菌体蛋白等。工业生产常用微生物4、霉菌：霉菌在自然界中分布很广，发酵工业常用的霉菌有：根霉、毛霉、曲霉、青霉等，主要用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。5、担子菌：担子菌就是人们常说的菇类。担子菌资源的利用越来越引起人们的重视，如多糖、橡胶物质、抗癌药物的开发等。6、藻类：许多国家已把藻类用作人类保健食品和饲料，如：螺旋藻；此外，某些藻类还能利用光能将CO2转变为石油，如：单胞藻。黑曲霉是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。青霉可用于生产抗生素、苯氧甲基青霉素酰化酶等。链霉菌是放线菌，生产葡萄糖异构酶、抗生素等。酵母菌主要用于生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶；作为基因工程的宿主菌，表述真核生物的外源基因。大肠杆菌细菌，可生产多种酶类，一般属于胞内酶，需要经过细胞破碎才能分离得到。作为基因工程的宿主菌枯草芽孢杆菌细菌，是应用最广泛的产酶微生物之一，可用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等；作为基因工程的宿主菌第四章4.1微生物细胞培养概述4.1.1培养基1、培养基的种类。（1）孢子培养基：孢子培养基是供制备孢子用的。要求此培养基能使微生物形成大量的优质孢子，但不能引起菌种变异。生产中常用的孢子培养基有麸皮培养基，大（小）米培养基，由葡萄糖（或淀粉）、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂斜面培养基等。（2）种子培养基：种子培养基是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。培养基的组成随菌种的不同而改变。（3）发酵培养基：发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。第四章4.1微生物细胞培养概述2、发酵培养基的组成。（1）碳源：构成菌体及产物的碳架及能量来源。（2）氮源：构成菌体本身的含氮物及代谢产物中的含氮物。（3）无机盐：构成菌体原生质成分，酶的组分或维持酶的活性，调节细胞渗透压，参与产物生物合成等。第四章4.1微生物细胞培养概述（4）生长因子：菌体自身不能合成，但对维持其正常生长又不可缺少的物质，如：维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物、脂肪酸等。（5）水：构成菌体细胞的主要成分、营养物质的传递介质、参与许多代谢反应。（6）产物形成的诱导物、前体和促进剂：某些胞外酶的合成需要诱导物，前体被菌体直接用于合成产物，促进剂能刺激菌株生长，提高发酵产量，缩短发酵周期。培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。培养基成分碳源糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物供给微生物生命活动所需要的能量以及构成菌体细胞成分和代谢产物。氮源蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、肉膏、酒泥硫酸铵、氨水、硝酸盐等供给微生物生长所需的氮素，构成菌体原生质无机盐、微量元素磷、镁、钾、钠等铁、铜、锌、锰、钴、钼等可以作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物4.1.2微生物菌种的改良、筛选与保存（一）微生物药物产生菌的菌种改良（二）新微生物药物的筛选（三）微生物药物产生菌的保藏1、菌种的改良（1）从自然界中先分离出相应的菌种；（2）利用诱变筛选出符合生产要求的优良菌种；（3）利用基因工程、细胞工程的方法构建工程细胞或工程菌。诱变育种凡是利用诱变剂处理分散而均匀的微生物群体，促进其基因发生突变的育种技术就称为诱变育种。其中诱变剂是指能诱致基因突变，明显提高基因突变频率的理化和生物因素。目的——将产生菌的一些有益变异，通过不断的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需要的高产优质新菌种。自然选育诱变育种杂交育种基因工程技术改良菌种1）自然选育在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。自然选育包括从自然界分离获得菌株根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。（1）从自然界分离获得菌株一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。调查研究（包括资料查阅）↓试验方案设计↓采样↓第一次增殖培养↓第一次平板分离↓第二次增殖培养↓第二次平板分离↓第二次原种斜面↓初筛（1株1瓶）增殖条件摸索→第一次原种斜面→←定性或半定量测定第三次平板分离↓第三次原种斜面↓复筛（1株3-5瓶）↓第四次平板分离↓第四次原种斜面↓再复筛↓较优化菌株1-3株初步工艺条件摸索→→第三次原种保藏←种子培养不纯保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验等（2）从自发突变体中获得菌株变异是育种的基础。自然突变是指自然条件下出现的基因变化。自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株——诱变育种。2）、诱变选育人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。诱变育种的主要环节：①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高；②用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。a.出发菌株的选择b.菌悬液的制备c.前培养d.诱变e.变异菌株的分离和筛选（1）诱变剂物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂各种射线，如紫外线、X射线、β射线、γ射线、α射线和超声波等乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。噬菌体、转座因子防护面罩防护衣防护罩各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间诱变剂诱变剂的剂量处理时间缓冲剂中止反应方法亚硝酸（HNO2）0.01～0.1mol/L5～10minpH值4.5，1mol/L醋酸缓冲液pH8.6，0.07磷酸二氢钠硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30min，孢子18～24hpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释甲基磺酸乙酯（EMS）0.05～0.5mol/L10～60min，孢子3～6hpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释亚硝基胍（NTG）0.1～1.0mol/mL，孢子3mg/mL15～60min，90～120minpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液大量稀释亚硝基甲基胍（NMU）0.1～1.0mol/mL15～90minpH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂或Tris缓冲液大量稀释氮芥0.1～1.0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀释乙烯亚胺1:1000～1:1000030～60min硫代硫酸钠或大量稀释羟胺（NH2OH∙HCl）0.1～0.5％数小时或生长过程中诱变大量稀释氯化锂（LiCl）0.3～0.5％加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释秋水仙碱（C22H25NO6）0.01～0.2％加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释2）影响诱变效果的因素①出发菌株的遗传特性；②诱变剂；③菌种的生理状态；④被处理菌株的预培养和后培养条件；⑤诱变处理时的外界条件等。a)选择合适的出发菌株b)采用分散状态的孢子悬浮液处理c)采用单核细胞（或核质体）处理d)注意微生物的生理状态e)适宜的诱变剂量2、菌种的筛选：初筛-复筛初筛：诱变结束后的筛选可以采用传统的随机筛选，也可以通过平板菌落筛选（推理筛选），即根据产生菌的生物合成途径或遗传机制来设计筛选有效突变型的方法初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。初筛方式：固体平板发酵——液体振荡培养——便于大量筛选抗菌物质时采用。放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。（1）常规的筛选方法琼脂扩散法——利用多种微生物作为检定菌，筛选有抗菌活性的物质。非致病菌抗生素耐药突变株和超敏菌株厌氧菌协同活性检测（2）定靶筛选从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。以作用机理为依据的筛选方法以耐药机制为依据的筛选方法β-内酰胺酶抑制剂的筛选β-内酰胺酶是一类能够破坏具有β-内酰胺结构抗生素的钝化酶的总称。许多致病菌由于产生β-内酰胺酶而对青霉素和头孢菌素具有抗性。β-内酰胺酶抑制剂的筛选主要依据抑制剂抑制β-内酰胺酶，使酶失去活性，不能水解β-内酰胺类抗生素，使抗生素保持生物活性，从而抑制细菌生长繁殖。耐药菌株平板法液体测定法联合使用β-内酰胺酶以及敏感和耐药突变株通过颜色变化来检测β-内酰胺酶抑制剂诱导β-内酰胺酶方法的应用高通量筛选高通量筛选（hi