襄樊市疟原虫镜检中心和镜检站管理方案

1襄樊市疟原虫镜检中心和镜检站管理方案（试行）根据省卫生厅下发的“关于加强全省疟原虫镜检工作”（鄂卫函〔2010〕365号）的通知要求，为了加强各级疟原虫镜检中心和镜检站的管理，特制订本方案：一、镜检中心及镜检站设置和管理（一）镜检中心及镜检站设置根据省卫生厅要求，市、县各级疾病预防控制中心应在寄生虫病防治科或检验科设置疟原虫镜检中心（简称“镜检中心”）。乡镇卫生院（私立医院）及各级综合医院（包括中心医院、传染病医院、妇幼保健院）检验科应设置疟原虫镜检站（简称“镜检站”）。（二）镜检中心管理各级镜检中心在分管主任（所长）的领导下，科室负责人具体负责，市级和县级镜检中心确定1～2名专兼职疟原虫镜检人员。（三）镜检站管理各镜检站在分管院长的领导下，检验科主任具体负责，确定1～2名（综合医院2名以上）检验人员负责疟原虫镜检。镜检站实行属地管理，县级属地综合医院和乡镇卫生院镜检站由县级镜检中心管理。所有镜检人员必须保持稳定，实行培训考核上岗制度。各镜检中心和镜检站建立疟原虫镜检人员个人档案，各镜检中心掌握所辖地区镜检人员基本情况，省级镜检中心掌握全省镜检人员基本信息。二、镜检中心及镜检站职责2（一）镜检中心职责1、制定血检计划市、县镜检中心分别制定所辖地区发热病人血检计划。2、镜检能力建设市、县镜检中心对所辖地区镜检人员开展疟原虫镜检技能培训；3、督导检查市、县镜检中心对所辖地区镜检工作进行督导检查。4、血片复查市、县镜检中心复核所有网络报告的疟疾血片，按比例抽查部分阴性血片。（二）镜检站职责1、血检开展辖区内发热病人血检，网络报告的所有疟疾病例除采制血片外，还需采制滤纸血膜。2、登记报告按要求进行血检登记、按时上报血检报表、保存全部镜检血片。三、镜检中心及镜检站任务（一）镜检中心任务1、制定血检计划市级制定所辖市级及以上综合医院和县（市、区）发热病人血检计划，县级制定所辖综合医院及各乡（镇）卫生院发热病人血检计划。血检数量以县为单位疟疾年发病率1/万以上，血检人数占常住人口的2%；1/万以下的县，血检人数占常住人口的1%；3年均无本地疟疾病例的县，血检人数占常住人口的2‰。全市疟区分类（附表）。2、镜检技术培训市级负责所辖县（市、区）镜检中心及市级综合医院检验人员的培训；县级负责所辖乡镇及县级综合医院检验人员的培训。各级疟原虫镜检技术培训率应达100%。33、复查血片县（市、区）镜检中心复核各乡镇卫生院及属地综合医院网络报告的所有疟疾病例的血片（疟疾血片），抽查各镜检站阴性血片5%，其中流行季节（5月～10月）每月一次及非流行季节（11月～次年4月）每3个月一次抽查和完成阴性血片的复检，次月中旬将复查的所有疟疾血片（含滤纸血）和抽查的阴性血片送市镜检中心复检；市级复检所辖县级镜检中心复查的所有疟疾血片和抽查送检10%的阴性血片，按照流行季节和非流行季节次月下旬将上月或上3个月复查的所有疟疾血片（含滤纸血）和抽查的阴性血片送省镜检中心复检。各级镜检中心复查血片后做好登记，登记内容为送检单位（市、县、乡）、血片编号、姓名、性别、年龄、镜检结果、复查结果、复查日期、复查医生签名。4、督导检查县级镜检中心每季度一次，对各乡镇和属地综合医院镜检质量和工作完成情况进行督导。市镜检中心每半年一次对所辖县（市、区）镜检中心及属地市级综合医院进行督导；省级镜检中心每年1～2次，对全省镜检中心及镜检站进行督导。各镜检中心督导重点为镜检站发热病人血检完成情况，血片制作和染色质量、血片保存、血检登记及报告；市镜检中心同时对下级镜检中心复查结果进行检查，主要内容为血片复查登记，血检报表、所辖区血检任务完成情况，发现问题及时指导和整改。（二）镜检站任务1、血检发热病人乡镇卫生院（私立医院）及综合医院镜检站全年按照湖北省疟原虫镜检站技术操作规范(见附件)开展4发热病人血检，血检对象为临床诊断疟疾、疑似疟疾和不明原因发热病人。各镜检站按照县级镜检中心计划完成血检任务，流行季节（5～10月）血检数应占全年血检总数的80%。2、血检登记按照血检登记本的要求逐项登记，血检登记本用完后保存在防保站或保健科。3、血片编号和保存所有血片编号与登记编号一致，并保存在玻片盒内。对诊断为疟疾、疑似疟疾和抗疟试治有效的病人采制滤纸血膜晾干后用塑料袋密封置冰箱4℃保存。4、血检报告疟疾流行季节每月报告一次，非流行季节每3个月报告一次。四、镜检站工作和质量考核为了促进镜检站的血检工作质量，根据镜检站的任务完成情况、血片复查结果等进行综合考核（镜检站考核内容及标准见附录2）。5附表：襄樊市疟区分类表一类疟区二类疟区三类疟区枣阳市南漳县襄城区襄阳区宜城市老河口市保康县谷城县樊城区注：全市按照2006-2008年疟疾发病分为一类疟区（发病率连续3年1/万以上）、二类（连续3年终有一年发病率在1/万以下）、三类疟区（连续三年无本地病例）。6附件1湖北省疟原虫镜检技术操作规范镜检疟原虫是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量特制定本操作规范。一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片使用前应清洗（清洗方法见《疟疾防治手册》）。采血针采用一次性采血针。玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。酒精棉球将95%医用酒精配制成75％酒精溶液，再将脱脂棉做成棉球（棉签），经无菌消毒后浸入75%的酒精液中，用于采血部位的消毒。记号笔用于玻片上书写号码。滤纸普通滤纸。（二）操作步骤1、采血采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75％乙醇棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。2、涂制血膜取玻片2张，1张做载玻片，1张作推片（边缘光滑的一面），用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4～5μl，再用该端中部刮取血液1～1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外一个方向旋转2～4圈，7涂成直径为0.8～1cm的圆形厚血膜（厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜）。用干棉球擦净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳（图1）。疟原虫镜检涂制血膜方法示意图1厚、薄血膜的位置每张载玻片上可做1个厚血膜和1个薄血膜（图2）。标准血膜示意图23、滤纸血膜对镜检发现疟原虫阳性患者或将作为疟疾疫情报告的病人应采制滤纸血膜2个，滤纸大小为8×2㎝，血膜直径1.2CM，血量20uL,待血膜晾干（滤纸血膜示意图3），再置塑料袋中干燥保存于冰箱4℃，实验室待检。8滤纸血膜示意图3二、染色（一）所需器材1、试剂吉氏染粉、甲醇、甘油、无水乙醇等（试剂配制方法见《疟疾防治手册》）。2、器具染缸、吸管若干。3、pH试纸常用广泛试纸。4、染色及冲洗用水蒸馏水或自来水pH7.2。（二）染色前血膜的保存血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥后才能染色。血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能即时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中1～2小时后取出血片。（三）操作步骤1、薄血膜固定染色前薄血膜要用甲醇或无水乙醇固定。2、厚血膜溶血染色前用蒸馏水或清水溶血，新鲜血膜可不溶血直接染色。3、染色染液的稀释和染色冲洗用水常用的是中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，为了使血膜着色较好，应用pH7.2编号9水效果最佳。单片染色：单张血膜染色可取蒸馏水或缓冲液1ml加入吉氏染液1滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色20～30分钟，然后水洗、晾干。多片染色：采用吉氏染液成批血膜染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2％吉氏染液(2ml吉氏原液与98ml蒸馏水缓冲液混匀），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2～3次，然后取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。重新染色法：褪色或染色效果不佳时，可先用二甲苯反复洗去血膜上的油迹，再用75％酒精滴在厚、薄血膜上，用水反复冲洗数次，至厚血膜不见蓝色为止。取1ml蒸馏水加入1滴吉氏染液，混匀后滴在厚、薄血膜上，染色1～4小时（根据血片存放时间而定)。清水冲洗2～3分钟，加1～2滴75％酒精于血膜上，1～2秒钟后用水冲洗，待干。（三）影响血膜染色质量的因素血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、血膜制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素有关:1、染剂和溶剂的质量染料、甲醇和甘油如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色效果。因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。新配制的染液应先试染，以酸碱度最适宜的水去稀释，看染色是否理想，否则需重新制备染液。2、染液的新旧新配制的染液，一般染色力较弱，且常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，尤以吉氏染液为10甚，故应在染色前1～2周先将染液制备好。盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量。3、染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢子及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果。4、染色时间：染色时间长，染色效果好，反之则染色效果差。染色时间长短与温度有关，温度高着色快，染色时间可适当缩短，温度低染色慢，则时间可适当延长。所以染色时间要随着染液的质量、新旧、浓度及温度而伸缩。5、稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色较好，应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.2的水稀释。当染色太蓝，可用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以校正。6、冲洗方法染色后不要直接将染液倒掉，应将玻片连同染液一起放在水中漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。三、镜检（一）器材1、显微镜单、双目显微镜均可，目镜一般以5X为宜（有的用10X），物镜必须用油镜（100X）。2、镜油液体石蜡3、擦镜纸（二）操作步骤1、血膜上滴加镜油滴一滴液体石蜡在血膜上，再将血片置载物台上。112、镜检用目镜5×和物镜10～40×低倍镜检下找到血膜，再将物镜转换成油镜（100×），查找疟原虫，吉氏染色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色，疟原虫的核呈红色。3、观察血膜的方法镜检时从血膜的一端开始，自上而下，自左而右，逐个视野顺序查看。发热病人血片至少要查完200个视野以上，普查带虫血片则需看完全片，方可报告结果。镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜作为疟原虫的分类定种。疟原虫镜检操作步骤（见示意图）。4、结果报告结果报告分阳性和阴性，阳性者至少要查见一个典型疟原虫（并需鉴别虫种和期别）方可确定；以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。四、登记和报告（一）登记镜检站对所查血片应按血检单和血检登记簿中的项目逐一登记。（二）上报血检结果应尽快报出，最迟不超过2小时报出（恶性疟、三日疟原虫立即上报）。五、注意事项镜检站应保持环境用具的整洁，要爱护显微镜，做到防尘、防潮、防霉，试剂和染色用具要顺序放置在固定的操作台上。登记、统计资料要有专人负责，并做好交接班手续。疟原虫镜检操作步骤示意图12镜检考核内容及标准疟原虫镜检2%吉氏染液（稀释液PH7.2）染色（30分钟）消毒75%酒精采血部位采血（耳垂或手指）镜检冲洗厚血