第四章发酵工业的无菌技术思考题1、染菌对发酵有什么危害,哪些原因会引起染菌?染菌以后应采取什么措施?2、简述好氧发酵时无菌空气制备的工艺流程与要求。什么是染菌?发酵过程中除了生产菌以外,还有其它菌生长繁殖。一、发酵工业的无菌处理灭菌(sterilization)是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种,前者指菌体虽死,但形体尚存,后者则指菌体杀死后,其细胞发生溶化、消失的现象。消毒(disinfection)是指用化学或物理的方法杀灭或去除病原微生物的过程,它一般只能杀死营养细胞而不能杀灭细菌芽孢。消毒是一种采用较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌,而对被消毒的物体基本无害的措施。除菌(degerming)是用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐(antisepsis)就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖,从而达到防止食品等发生霉腐的措施。如低温、缺氧、干燥、高渗、添加防腐剂等。消毒与灭菌的区别消毒与灭菌在发酵工业中的应用二、发酵工业污染的防治策略(一)污染的危害(二)污染的防治(一)污染(染菌)的危害1.染菌的不良后果(1)使发酵培养基因杂菌的消耗而损失,造成生产能力下降直至倒罐,造成巨大经济损失(2)由于杂菌的污染,对产物提取和产品质量造成严重的影响,如产物收率降低或产品质量下降。(3)杂菌的代谢改变原反应体系的PH,使发酵发生异常变化,(4)杂菌分解产物,使生产失败。(5)细菌发生噬菌体感染,细菌细胞被裂解,导致整个发酵生产的失败。2、染菌危害的具体分析(1)染菌对不同菌种发酵的影响A.细菌谷氨酸:发酵周期短,培养基不太丰富,较少染杂菌,但噬菌体威胁大。肌苷:缺陷型生产菌,培养基丰富,易染菌,营养成分迅速被消耗,严重抑制菌生长和合成代谢产物。B.霉菌PenG:青霉素水解酶上升,PenG迅速破坏,发酵一无所获。柠檬酸:pH2.0,不易染菌,主要防止前期染菌。C.酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌D.疫苗:无论污染的是活菌、死菌或内外毒素,都应全部废弃。(1)染菌对不同菌种发酵的影响(2)染菌种类对发酵的影响青霉素:怕染细短产气杆菌链霉素:怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素:怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸:怕染青霉菌肌苷(酸):怕染芽孢杆菌谷氨酸:怕染噬菌体,易造成连续污染污染噬菌体噬菌体的感染力强,传播蔓延迅速,也较防治,故危害极大。污染噬菌体后,可使发酵产量大幅度下降,严重的造成断种,被迫停产。污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫,即使添加消泡剂也无法控制逃液,影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸,致使pH下降,使不耐酸的产品破坏。芽孢杆菌耐热,不易杀死。由于接种量较小,生产菌生长一开始不占优势,而且培养基营养丰富,容易污染杂菌。种子染菌对发酵危害极大,应严格控制种子染菌,如在此阶段染菌,应将培养液全部废弃。(3)、不同发酵时期染菌对发酵的影响种子扩大培养期染菌发酵前期染菌发酵前期最易染菌。原因:发酵前期菌量不很多,与杂菌没有竞争优势;且还未合成产物(抗生素)或产生很少,抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。措施:可以用降低培养温度,调整补料量,用酸碱调pH值,缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌,且培养基养料消耗不多,可以重新灭菌,补加一些营养,重新接种再用。发酵中期染菌,处理困难,危害很大。处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。发酵中期染菌原因:发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸,培养液pH下降;糖、氮消耗快,发酵液发粘,菌丝自溶,产物分泌减少或停止,有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭,产生大量泡沫。措施:降温培养,减少补料,密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐,或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐,抑制杂菌。发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物,特别是抗生素,对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多,对生产影响不大。如果染菌严重,又破坏性较大,可以提前放罐。(4)、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响1)发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘,菌体大多数自溶,所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼,导致过滤困难。污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异如污染霉菌时,影响较小,而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难,过滤时间拉长,影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用,破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率,直接影响提取总收率。2)发酵染菌对提取的影响染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。如果采用有机溶剂萃取的提炼工艺,则极易发生乳化,很难使水相和溶剂相分离,影响进一步提纯。如果采用直接用离子交换树脂的提取工艺,如链霉素、庆大霉素,染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面,或被离子交换树脂吸附,大大降低离子交换树脂的交换容量,而且有的杂菌很难用水冲洗干净,洗脱时与产物一起进入洗脱液,影响进一步提纯。如果丝状菌发酵被产酸菌污染:则pH不断下降,菌丝大量自溶,发酵液粘度增加,过滤困难。处理方法:①将发酵液加热后再加助滤剂;②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。杂菌分泌较多蛋白质杂质时,对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利,使水相和溶媒之间极易发生乳化(二)杂菌污染的防治1.染菌的检查与判断染菌的检查方法:显微镜检查法镜检出杂菌需要一定时间平板划线培养或斜面培养检查法:菌落噬菌体检查可采用双层平板法:噬菌斑肉汤培养检查法发酵过程的异常现象判断:溶解氧、pH、尾气中的CO2含量、发酵液黏度、颜色等的异常变化,都可能是发生染菌的重要信息。溶解氧水平的异常变化污染好氧性杂菌,溶解氧在短时间内下降,并接近零值,长时间不能回升;污染非好氧性杂菌,生产菌受到抑制,耗氧量减少,溶解氧升高。pH异常变化对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快的杂菌,会使pH迅速下降。12尾气中CO2含量异常污染杂菌,糖耗加快,CO2含量增加;感染噬菌体,糖耗减慢,CO2含量减少。2、污染原因分析主要原因:①种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底⑤操作失误⑥技术管理不善染菌原因染菌百分率%种子带菌或怀疑种子带菌9.64接种时罐压跌零0.19培养基灭菌不透0.79总空气系统有菌19.96泡沫冒顶0.48夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作原因10.15原因不明24.94日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析上海第三制药厂染菌原因分析染菌原因染菌百分率%种子带菌14.15盘管穿孔14.20阀门渗漏23.30空气系统有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78管理不善而染菌,经分析有下表所列原因:染菌原因染菌百分率%进罐前未做设备严密度检查25.8接种违反操作规程25.8检修质量缺乏验收制度19.35操作不熟练19.35配料违反工艺规程6.45调度不当3.25(1)从污染杂菌的种类进行分析耐热芽孢杆菌:灭菌不彻底;球菌或无芽孢杆菌:种子染菌、设备渗漏、无菌空气带菌、操作失误;浅绿色杂菌:冷水管渗漏;霉菌:灭菌不彻底或操作问题;酵母菌:糖液灭菌不彻底或放置时间较长发酵前期染菌种子带菌、培养基灭菌和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角。发酵中后期染菌补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏,操作不合理,一般不会是种子问题。(2)从污染杂菌的时间进行分析(3)从染菌的程度进行分析数个发酵罐感染相同杂菌:空气系统;个别罐连续感染杂菌:设备问题;单罐染菌不是系统问题,而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效。个别发酵罐连续染菌:设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损),设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象。个别发酵罐偶然染菌:原因比较复杂,因为各种染菌途径都可能引起。多罐染菌系统问题,如空气过滤系统有问题,特别是总过滤器长期没有检查,可能受潮失效;移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底等。如果发酵罐偶而染菌,原因一时找不出时一般可以采取以下措施:(1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4一10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛,加热至80°C,存放处理4小时。(2)对染菌的罐,在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量每立方米罐的体积0.12-0.17升。(3)对染菌的种子罐可在罐内放水进行灭菌,灭菌后水量占罐体的三分之二以上。这是因为细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。3、杂菌污染的途径及其预防(1)种子带菌及其防治种子带菌的原因:①灭菌不彻底(如假压);②移种污染;③培养或保藏过程中污染;④无菌室管理不善;防止种子带菌措施:制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气,还要装紫外灯用以灭菌,或用化学药品灭菌。无菌室结构要求无菌室面积不宜过大,一般约4—6米2,高约2.6米。为了减少外界空气的侵入,无菌室要有1—3个套间(缓冲过道)无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子,要求无裂缝,墙角最好做成圆弧形。室内布置应尽量简单,最好能安装空气调节装置,通入无菌空气并调节室内的温湿度。无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。无菌室接种要求打开紫外灯,照半小时,关灯后15分钟再接种。消毒药水擦桌子、拖地,开启超净台的通风,接种时必须在超净台上操作,保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服,戴好口罩,手用酒精棉球擦干净。(2)过滤空气带菌及其防治无菌空气引起染菌的原因:流程或设备设计的合理性;过虑介质选用、装填;过虑介质的灭菌和管理;空气除菌系统复杂,环节多,偶遇不慎便会导致空气除菌失败。空气冷却器的列管穿孔泄露,冷却水会渗入到空气中,造成染菌。棉花-活性炭过滤器长期使用后变薄的一边失效。过滤介质受潮失效:过滤器灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气,将水分吹干。超细纤维纸作过滤介质,灭菌时必须将管道中冷凝水放干净,以免介质受潮失效。在生产实践中,空气管道大多与其它物料管道相接,要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管道污染过滤器,导致过滤介质失效。(3)设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治生产上常把不能彻底灭菌的部位称为“死角”发酵罐的“死角”法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件。口:人孔(或手孔)、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口。发酵罐罐底脓疱状积垢罐底的加强板发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”消除方法:加强清洗并定期铲除污垢;不锈钢衬里破裂造成“死角”法兰的“死角”a—垫圈内径过小;b—垫圈内径过大;c—法兰不平造成的泄漏与“死角”abc灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法管道安装不当或配置不合理形成的“死角”安装放汽边阀消灭死角的措施减少挡板和开孔;焊接光滑;法兰、阀门连接正好;减少残渣沉积;严格清洗和检查;定期检修易坏部件化学腐蚀电化学腐蚀磨蚀设备加工不良防止设备渗漏:包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。防止设备渗漏肉眼可见——冷却盘管、夹套穿孔、阀门渗漏……肉眼不可见——试漏水压试漏法集气桶试漏(4)培养基灭菌不彻底导致染菌及其防治培养基灭菌不彻底原因:原料性状:假压——“冷压”的形成;灭菌时培养基产生泡沫连续灭菌时参数不稳定——时间维持不够或压力波动较大;灭菌后期的罐压骤变——“负压”;设备死角。防治方法:原料性状:大颗粒的原料过筛除去