第四章细胞破碎.

1第四章细胞破碎2概述不同类型的细胞分泌目标产物的类型：动物细胞多分泌到细胞外培养液植物细胞多为胞内产物微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。3概述大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。4概述细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。51细胞壁结构微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。6细菌细胞壁结构几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；使细胞具有一定的形状和强度。7细菌细胞壁结构破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素大肠杆菌治疗侏儒病α-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等8酵母细胞壁的结构示意图最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。9真菌的细胞壁真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。10红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图11微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质细胞壁的组成和结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质细胞壁的组成和结构12植物细胞壁的结构对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～3μm），富有弹性。由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。13植物次生细胞壁某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。n在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。14细胞破碎方法方法技术原理效果成本举例化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵增溶法表面活性剂溶解细胞壁温和适中胆盐作用于大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁融解剧烈便宜表4.1-1.细胞化学破碎法15方法技术原理效果成本举例机械法匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动物细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理表4.0-1.细胞机械破碎法16※2CHEMICALMETHODS化学方法17n表4.1-1介绍了主要的几种化学方法，有渗透冲击法，表面活性剂增溶法、脂溶法。首先简单的介绍一下酶消化法和碱处理法。18酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法，但是也都有各自的缺点。191酶解（酶溶法Enymaticlysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等20外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。21外加酶法n酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。22酶解法的特点优点：发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在。23碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。24碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。碱处理法251）渗透压冲击法渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。26渗透流的动力来自渗透压，渗透压可能很大。可以通过化学平衡来估算，水的化学电势是常数，即：µH20(outside)=µH20(inside)(4.3-1)27细胞外纯水的化学电势包括标准化学电势和压力修正项；与之平衡的胞内的化学电势包括三项，即标准化学电势、压力修正相和浓度修正项。对于理想的不可压缩溶液，这些修正相和式（4.2-1）可改写为：µ0H20+VH2oPout=µ0H20+VH2oPin+RTln(1-x1)(4.3-2)28nµ0H20——标准化学电势VH2o——水的偏摩尔体积x1——细胞内所有溶质的总摩尔分数若包内物为稀溶液，其偏摩尔体积等于纯水的摩尔体积。且x1很小时就有：29Pout-Pin=(RT/--VH2o)×ln(1-x1)=(RT/--VH2o)×(-x1-…)=-RTc1+…(4.3-3)该式称为范特苛夫定律。30n由该方程知细胞内压力必须小于细胞外压力，否者，水会流入细胞内，溶破细胞。我们可以采用等式4.2-3估算出渗透压的大小。许多细胞内溶质浓度大约为0.1MNaCl或0.2M溶质。n由此可见渗透压必须很大，才导致了细胞的破碎。31通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%.化学渗透法特点：缺点对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。优点322）、增溶法第二种是利用表面活性剂的增溶法。最典型的是将体积为细胞体积两倍的某浓度的表面活性剂加入到细胞中。表面活性剂能将细胞壁破碎，制成的悬浮液可用离心分离除去细胞碎片，再用吸附柱或萃取剂分离制得产品。33细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。非离子型如TritonX-100和吐温（Tween）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解34n方法有效在于表面活性剂的化学性质，化学性质由图4.3-1所示的化学结构表示。结构中有一个亲水基团，通常是离子；一个疏水基团，通常是烃基。n表面活性剂通常是两性的，既能和水作用也能和脂作用。3536n无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的。SDS（十二烷基磺酸钠）是典型的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂还包括肥皂（脂肪酸盐）。37n由于肥皂的增溶作用依赖于羧基，因此只有在PH值较高，羧基解离的情况下，肥皂才是有效的表面活性剂。在硬水中，由于Ca2+与羧酸基团形成不可溶的沉淀，而使肥皂失效。38n可通过将肥皂的羧基用硫酸盐代替来改变传统肥皂的缺点。硫酸盐代替的肥皂是目前洗衣店常用及超市中常见的表面活性剂。硫酸盐可连在苯环上，结构如图4.2-1所示。这种硫酸盐表面活性剂比碱对细胞破碎的作用更好，磺酸盐不易被微生物降解，所以洗衣店中并不常用。39n阳离子表面活性剂主要是烷基胺盐。图4.3-1中的十二烷基溴胺是典型的例子。它有一个长烷烃链（十六烷基）和三个甲基，都连接在一个带正电的氮原子上，负离子通常是卤素，市场上常做洗发剂出售。细胞破碎时条件较温和。40n非离子表面活性剂是溶于水的聚合物。经济价值不明确，市场上用于做洗碗剂。同样，这种清洁剂既有亲水基团又有疏水基团。亲水基团不是硫酸盐，不是烷基胺盐而是乙醇。41n这类表面活性剂起作用在于能溶解细胞壁中的脂，进行细胞破碎。图4.3-2表示了该表面活性增溶的原理。在高度稀释洗涤剂中，脂会溶解在溶液中；超过这个浓度溶解的物质的量与浓度成正比。还有，表面活性剂的表面张力是常数，表面活性的选择电极可以突然改变。42能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等3）.有机溶剂43二机械法机械破碎法又可分为匀浆法（homogenization）珠磨法（beadgrinding）超声波破碎法（ultrasonication）44采用高压匀浆器（由高压泵