第四章胚胎

第四章胚胎，花药和花粉培养胚胎培养：是指将种胚及其相关器官或组织（子房、胚珠、胚乳）进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等背景HanningandLaibach建立了合子胚培养技术20世纪20年代建立了幼胚培养和胚胎拯救技术1934清华的李继侗和沈同发现银杏gingko胚乳提取物可刺激离体胚生长1940LaRue最先培养胚乳1941VanOverbeek发现椰乳对幼胚发育的促进作用之后胚胎培养技术逐渐成熟，1970Bhojwani白花寄生获得胚乳植株第一节胚胎培养一胚培养1.胚培养的用途1)克服远缘杂种的不育性:在高等植物的种间和属间杂交后代胚败育，胚发育不全而不能正常萌发，因而得不到杂种种子，用胚胎培养和试管受精技术就可以解决这些问题。2)克服了种子休眠和种子自交不育性，使胚发育不全的植物获得后代。如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植物。3）胚的拯救：远交的种胚常因胚乳发育不良而败育，败育前培养可得植株；早熟、生活力低的种子亦然。4)缩短育种年限在杂交育种中，应用胚培养技术可以缩短育种周期1～2年。5）获得单倍体植株远缘杂交结合胚培养，是获得单倍体的有效途径之一。6）诱导胚状体用幼胚或其他胚胎组织进行培养，可获得大量胚性愈伤和胚状体。7）胚胎发育研究。8）种子生活力的快速测定：未后熟和经后熟的种胚在离体培养下萌发速率一致。用于休眠期长的植物。2、内容：包括胚胎发育不同时期的胚，一般分为未成熟胚（子叶期前）和成熟胚（子叶期后）的培养。成熟胚培养较易，在含大量元素和糖的培养基上就能培养成苗。未成熟胚培养较难，需提供必需的营养和条件。3.胚培养的技术3.1成熟胚方法：种子→表面消毒→无菌水冲洗→剥胚→接种于简单培养基→培养。培养条件：具休眠习性者，4℃处理后转入常温培养25度；12h左右光照。3.2幼胚方法：胚珠→表面消毒→解剖镜下剥胚（带胚柄）→接种→培养。培养基：成熟胚对培养基要求不高，而幼胚要求较高，MS，B5，Nitsch培养基，其他适于未成熟胚和幼胚培养。幼胚需要较高的蔗糖浓度，以提供较高的渗透压，但由于幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，并具有较高的渗透压，所以人工培养基中要创造高渗透压的条件，使它可以调节胚的生长，阻止可能渗透压的影响，并能抑制中早熟萌发中的细胞延长，以及抑制胚的萌发，避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。Nitch、MS、B5培养基；胚乳看护培养：培养基中加同种/相近种的胚乳。高浓度蔗糖（8~12%）：模拟胚乳高渗环境；适量的激素：GA3、IAA等，刺激幼胚发育。温度：对于大多数植物的胚来说，在25～30℃为宜。光暗交替培养较为有利。4.离体胚发育途径1)一种是继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；2）另一种是在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性生长，通常称为“早熟萌发”；指幼胚在离体培养条件下，越过正常胚胎发育阶段，在未达到生理和形态成熟的情况下，萌发长成幼苗的现象。越过某一发育时期，如子叶形期而提早萌发，苗瘦弱，常死亡。措施：增加培养基中糖和无机盐的浓度，提高培养基渗透压。添加ABA；高温、强光照下培养。3）第三种是在很多情况下，胚在培养基中能发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。特别是进行生长调节时，就更为如此。培养基成分不适宜，如激素浓度较高，幼胚→（较多胚性）愈伤→再生植株。二、胚珠培养将受精或未受精胚珠进行离体培养。1.胚珠培养的用途1）成熟胚小或幼胚培养难成活时，用受精胚珠培养。1958，Maheshwar，授粉5d的罂粟胚珠（合子或2细胞原胚）培养得到种子。2）未受精胚珠培养可诱发大孢子发育成单倍体植株，克服花粉单倍体植株白化苗问题。1980开始，非洲菊、烟草、甜菜、柑橘等成功。3）未受精胚珠培养可为离体受精提供雌配子体。2.胚珠培养技术花蕾→取子房→灭菌→无菌水冲洗→取胚珠→接种→培养。有时，连同胎座或用子房进行培养。3.影响胚珠培养的主要因素1）胚囊发育时期：是关键，水稻未受精胚珠培养单核~四核期较好。2）胎座和子房：提供营养和激素。3）培养基：常用Nistch，MS、N6、B5也可。三、胚乳（endosperm）培养胚乳：被子植物双受精产物，三倍体；大多数植物随胚的发育，胚乳常被耗尽（豆科、葫芦科）。在胚乳培养中，除少数寄生或半寄生植物可以直接从胚乳分化器官以外，绝大多数被子植物的胚乳，无论成熟还是未成熟，都要先经历愈伤组织阶段，然后才能分化出植株。1.胚乳培养的用途1）获得三倍体：无籽西瓜、香蕉、甜菜、杨树等，重要经济价值。2）获得非整倍体：如三体，遗传研究和育种材料。3）获得同源六倍体：将胚乳三倍体加倍。4）理论研究系统：均质薄壁细胞，研究淀粉、蛋白、脂类等生物合成代谢。2.胚乳培养技术取授粉后4~12d的幼果→常规消毒→切开果实、取种子→剥取/分离胚乳→接种→暗培养→愈伤组织→分化培养→器官或体胚途径再生植株。3.影响胚乳培养的主要因素1）胚乳发育时期受精→胚乳核→游离核型期→细胞型期（有壁）。取细胞型期、旺长的胚乳易成功（胚已分化），半透明固体状、有弹性；大戟科等木本植物，成熟胚乳也可。2）培养基成分常用White,LS,MS等;添加CH等有机物和激素：可促进愈伤形成。3）胚因子的影响幼胚乳带胚易成功；成熟胚乳常不能脱分化，需先进行“原位胚”萌发使其活化，借助“胚因子”才能形成愈伤。GA3可部分代替胚因子的作用。四、离体授粉（invitropollination）在人工控制条件下，使离体的胚珠、子房、胎座或雌蕊等完成授粉、受精，形成种子的过程。包括雌蕊/子房离体受精和胚珠试管受精。1.离体授粉的意义1）克服远缘杂交的不亲和性受精前不亲和：花粉不能萌发；花粉管不能进入胚珠；花粉管在花柱中破裂。2）克服自交不亲和性自交不亲和：花粉不能萌发；花粉管不能长入子房。3）诱导孤雌生殖用异源花粉授粉，诱导卵细胞、助细胞和反足细胞等产生单倍体。4）植物受精机制和生理研究。2.离体授粉技术1）雌性外植体的培养：取花蕾→去花瓣、花萼等→表面消毒→剥取雌蕊、胚珠或子房等→接种→培养。2）花粉的灭菌：取花药→收集花粉→表面消毒。3）离体授粉：将无菌的花粉授于培养的胚珠、子房、胎座等。方法：将花粉粒直接撒于胚珠；用花粉悬液注射或滴加于子房；将花粉授于培养的雌蕊柱头等。3.影响离体授粉的因素1）雌性外植体发育阶段：雌性外植体成熟度与培养成活率一般呈正相关。2）花粉萌发力：用钙、硼、蔗糖等对花粉进行预处理，提高萌发率。3）母体组织的影响：保留胎座、花柱等组织，并提供相关因子，可提高成功率和结实率。4）培养基：添加CH、增加蔗糖和B族维生素等，利于胚珠培养或促进花粉萌发和花粉管生长。第二节花药和花粉培养花药和花粉培养实际上都是通过培养小孢子获得单倍体再生植株。一.培养条件下小孢子的发育1.自然条件下小孢子的发育未分化花药→孢原组织→造孢组织→小孢子母细胞→四分孢子→小孢子（单核早期→单核靠边期）→双核期（1个营养核+1个生殖核）→成熟三核花粉（1个营养核+2个生殖核）。小孢子只进行2次分裂！从小孢子母细胞→四分孢子，为孢子体；从单核小孢子→成熟三核花粉，为配子体2培养条件下小孢子的发育小孢子第二次分裂偏离正常途径，四种情况：1）营养细胞发育途径；2）生殖细胞发育途径；3）营养细胞和生殖细胞并进发育途径；4）均等分裂途径。无论哪种，花药→单倍体愈伤/胚状体→破药壁→单倍体植株。二.花药培养花药培养：指将花粉发育到一定阶段的完整花药接种到培养基上，诱导小孢子经孢子体途径形成单倍体再生植株的技术，又称雄核发育(androgenesis)。1花药培养技术流程选花蕾→表面消毒→取花药+花丝→镜检发育时期（醋酸洋红）→从花丝上摘花药→接种→培养。2花药培养再生途经1）间接雄核发育：小孢子分裂产生愈伤，再经器官或胚状体发生途径形成小植株。2）直接雄核发育：烟草、曼陀罗等少数植物，小孢子直接分化成胚状体/花粉胚，待一定大小时为促进发育，移到生根培养基上形成小植株。3影响花药培养的因素1）基因型：重要因素。2）供体植株生长条件：控制条件下生长，便于根据花蕾或花药长度等判断花粉发育时期。3）供体植株的年龄：一般，幼年植株优于老年植株，开花初期优于开花后期。4）花粉发育时期：一般从单核早期到双核早期，进入二核期后发育方向预定，再作改变难度较大。5）花蕾和花药的预处理：低温：4~13℃，也可在接种后进行；热激：高于常温约5℃；饥饿：无糖或无氨基酸培养基；γ射线照射;秋水仙素、脱落酸、高低渗等。几~十几天;上述因子的结合可能更有效。目的:诱导小孢子胚胎发生，促进花粉胚形成。机理:可能调节细胞周期，改变细胞分化发育方向。6）培养基：MS、N6。蔗糖:必须，且浓度较高。激素:关键，如2,4-D在花粉愈伤和胚诱导时必须，但在分化和发育时应降除。需经预实验确定。有机物、pH:有些植物有一定要求。活性炭：可提高烟草、玉米等单倍体诱导率。7）培养条件：有些植物接种后经一定的低温或高温处理，可提高诱导率；一般在愈伤或花粉胚诱导阶段暗培养，分化阶段光照培养。4单倍体植株的加倍单倍体植株矮小瘦弱、高度不育，须进行加倍。诱导剂：1）秋水仙素：微管聚合抑制剂，注意时间和剂量。可在培养的任何时期加倍，如在培养基中添加、浸苗、涂抹茎芽生长点等。是诱变剂，时间过长易出现混倍体和嵌合体，并引起变异。2）氟乐灵:微管聚合抑制剂，比秋水仙素药效大。三.花粉培养花粉培养：将离体的花粉粒接种到培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。花粉的二型性（pollondimorphism）：在自然或离体培养条件下，同一花药中存在大、小2种类型花粉粒，通常小花粉/S-花粉在适宜培养条件下会发育成胚状体，而大花粉为非胚性，朝成熟花粉方向发展，此现象即~。S-花粉又称胚性花粉,即E-花粉。早期镜检发现：1花粉与花药培养的比较1）异同点：（1）培养目的相同，均获得小孢子植株。（2）外植体不同，花药（器官）与花粉（细胞），花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。（3）单倍体起源的本质同，（4）花粉比花药培养技术难度大。2）花粉培养的优势：（1）花药中有害物质会影响小孢子的第一次分裂，花粉培养不存在此问题。（2）花粉植株都是单倍体，不含由药壁、花丝等诱导的体细胞植株。（3）花粉是研究发育、吸收、遗传、转化和诱变的理想材料。花粉培养的优势：2花粉的分离与培养2.1分离花粉的方法1）自然释放法：花蕾消毒→花药接种于液体或固体培养基→花粉释放→去药壁。2）研磨过滤收集法：花蕾消毒→培养基/分离液里研磨→筛网过滤→离心收集→洗涤→接种。3）剖裂/挤压释放法：用工具剖裂或用玻棒、注射器活塞挤压花药（在液体培养基中）→释放花粉→培养。2.2花粉培养技术1）液体浅层培养：用液体培养基将小孢子配成悬液，取少许在培养皿中形成一薄层，待愈伤或胚状体形成后再转移到分化或发育培养基上。2）固体平板培养。3）看护培养：花药上放滤纸，滤纸上放花粉。4）微室悬滴培养：制备花粉悬滴，即每个皿滴几滴花粉液，将皿倒置培养，便于观察。5）条件培养：培养花药（几天）→沸水杀死→研碎→离心→取上清→加入培养基→接种花粉。提取液中有促进发育因子。花粉培养的植板率：形成愈伤/胚状体的花粉数占培养的花粉总数的百分比（%），即为~。四.小孢子单倍体诱导的分子机制研究目的：克隆特异/相关基因，进行遗传操作和控制。油菜、小麦、烟草等，已鉴定、分离出一些基因。初步结果：一些为花粉萌发和受精所必须的花粉特异性基因的下调表达与孤雄生殖的诱导有关，所以关闭或抑制这些基因的表达应是遗传操作的目标。五.花培中存在的问题1禾本科的白化苗现象禾本科花药和花粉培养中白化苗达10~30%，甚至更高。影响白化苗形成的因素：1）基因型和花粉发育时期；2）高温、高浓度2,4-D、分化培养不及时：增加白化苗。3）低温处理：随植物而异，水稻长时间低温处理增加白化苗，大麦相反。白化苗产生机理：不清楚。质体基因组变异、花粉染色