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等位基因特异性PCR的原理与应用2015.1.16内容概要基本原理实验方法临检项目—KRAS、EGFR突变检测科研应用—BSG位点分型等位基因特异性PCR的基本原理单核苷酸多态性（SNP）检测方法限制性酶切片段长度多态性（RFLP）单链构象多态性（SSCP）变性高效液相色谱（DHPLC）异源双链分析（HA）基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）动态等位基因特异性杂交（DASH）基因芯片法TaqMan探针技术焦磷酸测序法……？操作繁琐耗时长产物污染灵敏度低仪器昂贵等位基因特异性PCR•等位基因特异性PCR（AlleleSpecific-PCR，AS-PCR）•又称扩增阻碍突变系统PCR（AmplificationRefractoryMutationSystem-PCR，ARMS-PCR）PCR扩增过程中，引物从3’末端开始延伸，要求3’端碱基与模板完全配对等位基因特异性PCR基本原理YouF.M.2008,BMCBioinformaticsTwoAllele-Specific(AS)primers,oneforeachalleleofaSNParedesigned.TheASprimerscontainoneoftwopolymorphicnucleotidesattheprimer3'end.Twosetsofprimers,eitherforwardorreverseprimerscanbedesigned.IfacommonreverseorforwardprimerisusedinaPCRreaction,thereactioniscalledallele-specificPCR(AS-PCR).四引物法ARMS-PCR单管反应凝胶电泳耗时长开管操作易污染缺陷：使用荧光定量PCR检测realtimePCR速度快闭管操作不易污染等位基因特异性PCR技术特点灵敏度高（0.1-1%）操作简便周期短不产生PCR产物污染适用样本类型多（如FFPE）精确突变类型方法建立需时较长仅能检测已知突变适用于临床检验优点缺点测序法与等位基因特异性PCR法比较Sanger测序法焦磷酸测序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE标本成功率低较高高商用试剂盒无有有流程与速度1-2天2-3天1天数据分析要求高高低试剂成本低低略高仪器成本高高低等位基因特异性PCR的实验方法操作流程及数据解读实验操作收到样本之后：试剂盒（以友芝友EGFR试剂盒为例）编号位点内容规格1G719XPCR缓冲液、G719X引物探针、内标、参比染料ROX23μl2S768IPCR缓冲液、S768I引物探针、内标、参比染料ROX23μl3T790MPCR缓冲液、T790M引物探针、内标、参比染料ROX23μl4L858RPCR缓冲液、L858R引物探针、内标、参比染料ROX23μl5L861QPCR缓冲液、L861Q引物探针、内标、参比染料ROX23μl6INSPCR缓冲液、Ins引物探针、内标、参比染料ROX23μl7DELPCR缓冲液、Del引物探针、内标、参比染料ROX23μl8质控（外控）PCR缓冲液、质控引物探针、内标、参比染料ROX23μl突变探针：FAM荧光标记；内标探针：VIC荧光标记PCR扩增•ABI7500•开机，仪器自检；•将准备好的8连管放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序；•信号采集：EGFR基因：FAM通道；内标：VIC通道；•PCR反应条件：37℃：10分钟95℃：5分钟95℃：15秒60℃：60秒核酸扩增区40循环阴性对照和阳性对照•阴性对照（空白对照）应无FAM荧光信号产生，或Ct值≥38•阳性对照（弱阳性对照）FAM通道Ct值≤32，VIC通道Ct值38，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。无DNA污染验证PCR有效性样品的外控和内控•待测样品的外控（8号管FAM信号曲线）应有FAM信号以友芝友试剂盒为例：FAM通道23≤Ct值≤30；•待测样品的内控（1-7号管的HEX/VIC/JOE信号曲线）应有扩增曲线以友芝友试剂盒为例：样品检测中VIC通道Ct值38。Ct23：DNA加入过量30Ct34：DNA加入量较低Ct≥34：需重新制备样本结果判定反应液突变类型阴性阴性阳性Ct值Ct值ΔCt值Ct值ΔCt值G719XPCR反应液G719XCt38或无Ct值Ct≤38≥9Ct≤389S768IPCR反应液S768ICt38或无Ct值Ct≤38≥8Ct≤388T790MPCR反应液T790MCt38或无Ct值Ct≤38≥8Ct≤388L858RPCR反应液L858RCt38或无Ct值Ct≤38≥7Ct≤387L861QPCR反应液L861QCt38或无Ct值Ct≤38≥7Ct≤387InsPCR反应液插入Ct38或无Ct值Ct≤38≥7Ct≤387DelPCR反应液缺失Ct38或无Ct值Ct≤38≥7Ct≤387ΔCt=突变检测Ct–内控检测Ct以友芝友EGFR试剂盒为例临检项目—KRASKRAS背景•KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信号通路的调控；•EGFR在通路中位于KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致KRAS的活化和通路中信号传导；•KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（65%-90%）、结直肠癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。KRAS基因突变影响结直肠癌药物疗效•KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从EGF抗体（西妥昔单抗、帕尼单抗）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；KRAS突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于KRAS野生型患者KarapetisCS,2008,NEngJMed结直肠癌患者检测KRAS突变相关指南•欧洲药品评估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。•美国临床肿瘤学会（ASCO，2009）推荐：转移性结直肠癌患者应检测KRAS突变，如有KRAS12、13位突变，则不应进行EGFR单克隆抗体治疗；•美国FDA指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测KRAS基因的基因型；2012年7月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（Qiagen），以判断西妥昔单抗是否有效；•美国国立综合癌症网络（NCCN，2014）指南说：转移性结直肠癌患者均应进行RAS突变检测（KRAS和NRAS），至少应检测KRAS第二外显子的突变情况。KRAS或NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。•中国卫生部于2010年10月14日发表了《结直肠癌诊疗规范（2010版）》。明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的K-ras基因状态。在晚期/转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤K-ras基因状态，EGFR不推荐作为常规检查项目。KRAS突变影响非小细胞肺癌药物疗效•KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗。KRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线所示）AndersonSM,2011,ExpertRev.Mol.DiagnEberhardDA,2005,JClinOncol非小细胞肺癌患者检测KRAS突变相关指南•美国国立综合癌症网络（NCCN，2009）指出，KRAS突变与非小细胞肺癌患者TKI抵抗有关，KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合TKI治疗。当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。KRAS主要突变位点•在结直肠癌中，KRAS突变主要发生于codon12(80%)、codon13(15-20%)、codon61和146(5%)；在肺癌中，约97%的KRAS突变发生于codon12、13，其余位于codon61和146。突变密码子碱基变化CosmicIDGly12Asp12GGT＞GAT521Gly12Val12GGT＞GTT520Gly12Ala12GGT＞GCT522Gly12Ser12GGT＞AGT517Gly12Cys12GGT＞TGT516Gly12Arg12GGT＞CGT518Gly13Asp13GGC＞GAC532拟开发产品•特异性引物：7条（已验证特异性）•参照引物：1条（已验证特异性）•下游引物：1条（已验证特异性）•Taqman探针：1条（已设计，待订购）•锁核酸阻滞探针：1条（已设计，待订购）•阳性对照：包含7种突变的质粒DNA模板（已制备并测序）•Taq酶，最好为TaqGold（hotstartenzyme)•qPCR混合反应液项目进展-KRAS•第二批引物能较好区分质粒DNA突变（SYBRgreen染料，ABI7500）模板引物Cт516516P24.03719517516PUndetermined518516PUndetermined520516PUndetermined521516P36.00975522516P38.87938532516P39.47913WT516PUndetermined阴参516PUndetermined模板引物Cт516517PUndetermined517517P23.0278518517PUndetermined520517PUndetermined521517PUndetermined522517PUndetermined532517PUndeterminedWT517PUndetermined阴参517PUndetermined516位突变517位突变项目进展-KRAS模板引物Cт516532P36.52584517532P36.80177518532P36.39018520532P37.23503521532P36.97367522532P37.01616532532P16.01479WT532P31.0284阴参532PUndetermined模板引物Cт516CP19.89434517CP19.90041518CP19.23109520CP19.56911521CP18.96716522CP18.51238532CP18.76427WTCP19.11962阴参CPUndetermined532位突变参照引物临检项目—EGFR检测EGFR突变背景•EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)基因位于染色体7p11.2，大小192kb，是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。•研究发现EGFR突变与吉非替尼、厄洛替尼的疗效密切有关。其中EGFR突变的患者对吉非替尼、厄洛替尼治疗敏感，有效率在80%以上；而EGFR野生型的患者的有效率在10%以下。•EGFR酪氨酸激酶上外显子18-21为最常见的基因突变位点，也是靶向药物吉非替尼结合的位点，外显子19缺失和外显子21的L858R突变是最常见的与吉非替尼疗效相关的敏感突变。EGFR突变影响非小细胞肺癌药物疗效研究表明EGFR突变型患者使用吉非替尼的疗效要优于卡铂与紫杉醇组合治疗，而在野生型患者中则相反，使用吉非替尼的疗效不如卡铂与紫杉醇组合治疗。MokT.S.2009,NEngJMedMaemondoM.2010,NEngJMedEGFR突变检测相关指南•美国国家综合癌症网络(NCCN)2011版的癌症治疗指南中明确指出：EGFR突变，尤其是外显子19的缺失突变和外显子21的L858R突变，与肿瘤对TKIs如吉非替尼治疗敏感性有重要关系。而部分EGFR-TKI初始治疗有效的患者后期会发生耐药，与EGFR外显子20突变密切相关。•美国临床肿瘤学会（ASCO）在JCO上发表报告：EGFR-TKI是携带E