等离子纳米材料在生物诊断上的应用

1等离子纳米材料在生物诊断上的应用摘要：近年来，生物诊断方法飞速发展，表面增强拉曼散射（SERS）为待测物提供了“化学指纹”，使得生物诊断达到的了分子水平，但是现有诊断方法存在耗时长、设备试剂要求高、检测极限低，SERS信号弱等缺陷而不利于在实际临床中推广。贵金属纳米颗粒的局部等离子共振属性能够很好的解决上述问题。其本身的吸收光谱特性能够在不同条件下产生快速的、肉眼可分辨的明显颜色变化，此外，等离子纳米材料的存在使得SERS信号的数量级提升数倍1，推进了无标记（label-free）SERS的应用2,3。本文章的重点放在近年来所报道的LSPR在生物诊断上的应用，从生物标志物检测、药物系统示踪、细胞组织成像和DNA检测四个方面分别研究相应的生物探针的构造方法、作用机理和应用。关键词：局部等离子共振；生物诊断；药物示踪；细胞组织成像；DNA检测金属纳米颗粒（如金纳米颗粒），在临床诊断中显示出巨大的前景，由于其具有表面等离子共振（SPR）现象而被用于检测目标生物分子；SPR是由于被入射光激发时电子的集体震荡，该入射光的频率和表面电子震荡（由于原子核吸引产生）的固有频率。金属纳米颗粒的等离子表面的光学激发导致纳米尺度的局部电磁场纳米空间约束场或局部表面等离子震荡（LSPR）。当入射光波长和纳米颗粒的LSPR频率相符合时，这个局部场增加到最大。对于等离子纳米颗粒，LSPR会产生在可见光频率上的显著的吸收峰，以及在颗粒表面的强电磁场，该电磁场能够极化纳米颗粒周围局部的空间4。这意味着在纳米颗粒和溶液接触面的相互作用影响共振情况，可通过吸光度的变化以及溶液颜色变化来检测。例如球形的分布均匀的AuNPs的SPR会产生特定的亮红色溶液，可以通过改变Au纳米结构的形态产生光学属性的巨大变化，由此调整SPR波长和溶液的颜色；金纳米棒（AuNRs），自由电子能够沿着长轴和短轴震荡，产生两种等离子波长；通过改变棒的长宽比，可以使得长轴等离子波长在近红外区（NIR），适用于700-900nm范围的探测器检测，此时血红蛋白和水的吸光度最低，能够最大限度使光穿过血液和组织，Kabashin使用纳米金棒组装成超材料作为基底，最终检测极限的显著改进阐明了该方法的灵活性5。此外，和AuNPs相比，它们显示出更强的光吸收和更高的散射截面在SPR波长范围。金纳米星（Aunanostars）在突出的尖角上有增强场，能够轻易被被测分子获得，LSPR峰向NIR移动6。传统实验中，等离子热点是通过纳米颗粒的化学聚集产生的，这种聚集一般是不可逆的，因此纳米颗粒不能重新分布在溶液中进一步使用。Partha等人通过交替开关单瞬逝光波，实现在金属-溶液的界面的等离子纳米颗粒可逆的组装7。本文章的重点放在近年来所报道的LSPR在生物诊断上的应用，从生物标志物检测、药物系统示踪、细胞组织成像和DNA检测四个方面分别研究相应的生物探针的构造方法、作用机理和应用。1.生物标志物检测生物标志物（Biomarker）是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，可用于疾病诊断、判断疾病分期，因此，对生物标志物的检测尤为重要。传统生物检测生成一个信号，该信号是和待测物浓度直接成正比，因此待测物最低浓度导致最小信号响应。Lorenzo等人8做的实验使用相反方法，使得信号和待测物浓度成反比。这意味着当目标分子的浓度在最低时，信号最大。如图Figure1所示，该检测是基于Ag纳米粒子在Au纳米星溶液中，银在金上的取向附着生长导致金纳米星的LSPR蓝移。其使用葡萄糖氧化酶（GOx）来控制Ag纳米结构的生长。GOx生成过氧化氢，减少银离子，决定了Ag在溶液中是2成核还是围绕金纳米星取向附着生长。低浓度GOx使Ag粒子附着，产生LSPR的蓝移信号。而在高GOx浓度时，独立成核更容易，导致LSPR的偏移的减弱。GOx和抗体相连，并且在经典酶联免疫法中在Au纳米星表面作为标记物。该试验也可用来检测前列腺特异抗原（PSA），在全血清中这是一个重要的癌相关的生物标志物。该方法能够使极限降为10-18gmL-1（4×10-20M），这是显著的低检测极限。Figure1（A）葡萄糖氧化酶控制的Ag的沉积/成核，影响Au纳米星的LSPR的偏移。（B）金纳米星TEM成像（50nm尺度）。（C）浓度响应曲线显示反比例敏感，LSPR光谱偏移随着在血清中PSA浓度。超灵敏检测常常仅在使用精细的昂贵的设备和试剂才能被观察到。在资源被限制的情况下，以下技术能帮助处理一些实验条件不佳的实验。Rica团队9研究了超敏ELISA，通过使用AuNPs的等离子属性来产生低浓度待测物的比色反应，可被肉眼直接观察。作为标准ELISA检测，分析分子被固定在基底的特定抗体捕获。一旦被捕获，之后的洗涤液引入主要抗体和酶标记的第二抗体复合体，该酶催化分解过氧化氢。将AuNP前体（三水合氯化金）加入到ELISA板上，体系中过氧化氢的浓度影响AuNPs的生长，过氧化氢浓度高则更易于形成非聚集的球形NPs，溶液颜色为红色；过氧化氢浓度低则更易于形成聚集的NPs，溶液为蓝色。蓝色和红色可以容易的通过肉眼分辨，如图Figure2所示，不需要昂贵的分析设备来读取信号。使用PSA和HIV-1壳抗原p24可以被检测在全血清中，超低浓度10-18gmL-1。Figure2酶控AuNP成核和聚集状态通过H2O2演变引起比色响应HIV-1壳抗原p24，BSA作为对比组。很多基于SERS的免疫实验已经使用小的拉曼标记偶联到使用配体修饰的AuNPs上，但是由于特定的拉曼标记过弱导致低灵敏度，因此使用LSPR来提高SERS信号。Dai等人10使用单层碳纳米管（SWNTs）来提高显色，多个蛋白在一个微阵列中进行检测，如图Figure3所示。由于SWNT标签，生成强SERS信号，这能够使得蛋白检测的LOD达到1fM，由于不同的最小可变反应二次抗体，通过使用12C和13C同位素SWNTs，SWNTs能同时检测两种目标蛋白。因此，在临床多模检测蛋白和生物标志物的应用中，“多颜色”的SWNTs提供一个有效的SERS方法。3Figure3双层，直接，微阵列蛋白检测，基于C12和C13的SWNTs标签。C12和C13的SWNTs连到GaM和GaH-IgGs上，提供人或老鼠的IgGs特异性连接。（B）C12（红色）和C13（绿色）SWNT标签的拉曼散射光谱。（C）C12（红色）和C13（绿色）SWNT标签拉曼散射图，能够简单的解决此问题，多模IgG检测。最近，VanDyune’s等人研发了皮下在体葡萄糖检测，设备类似小老鼠的模型（ratmodels）11-13。银薄膜表面被DT和6-巯基-1-己醇（MH）修饰后植入皮下。如图Figure4所示，DT/MT可以提供两性功能，形成亲水点，将葡萄糖固定在SERS活跃区，同时排除了血浆蛋白的干扰，这能够引起光谱相移。该方法能够获得高精度检测，尤其在低葡萄糖浓度时。并且可以在一次植入后使用较长时间。该探测器可在较低葡萄糖浓度下保持有效17天（12天由激光照射）。因此，基于SERS探测显示巨大前景在可持续葡萄糖监控中，可用于ICU病人的实时监测。2.药物示踪和增强探究单分子或单纳米材料的内吞过程对于理解细胞与物质的相互作用是重要的，并且可以用于药物释放和示踪，通过对药物释放过程的追踪，可以了解药物代谢路径，作用效果以及有效机制。Hong等人14基于等离子原理，利用碳纳米管在金等离子基底上的近红外荧光增强效应。他们使用SWCNTs通过氨键连接RGD缩氨酸使其能够选择性地连接到αvβ3-整合素，这个在U87-MG恶性胶质瘤中过表达。如图Figure5所示，纳米管在等离子膜和底层的Au薄膜之间，由于靠近荧光增强表面而显示高荧光；一段时间后，膜内部表面的网格蛋白组装和膜向内弯曲，包裹纳米管，导致了荧光的减弱；之后继续进入，最终完全脱离膜，此时增强效应非常微弱，由此可以实现示踪。之后该研究组又进行了多个温度和无网格蛋白的对照试验，内部表面细胞摄取和跨膜显示明显的依赖于温度和细胞膜上网格蛋白的组装。Figure4（A）AgFONs由自组装的纳米球沉积的金属构成。AgFON被DT和MH修饰。葡萄糖在DT/MH层聚集。最终结构在原子力显微镜下显示（右上）。（B）SERS光谱用于定量检测葡萄糖，其中I代表DT单层在AgFON基底上；II混合DT单层和葡萄糖；III剩余葡萄糖光谱通过I-II；Ⅳ结晶的葡萄糖的常规拉曼光谱。4Figure5细胞内吞单纳米管过程原理图，由初始的纳米管在等离子膜和底层的Au薄膜之间，最终完全脱离膜。GaryB等人15使用由多种染色剂修饰的银纳米颗粒组成的等离子纳米探针通过刻蚀将细胞外部的颗粒去除，使其能够使得进入细胞而保护起来的纳米颗粒更为清晰的显示，可用于实现肿瘤细胞内吞的药物示踪。如图Figure6所示，可通过等离子增强的AgNPs，在细胞外部被去除，实现细胞内纳米颗粒聚集成像、对颗粒进行细胞内示踪、区分修饰不同染色剂的颗粒在肿瘤细胞内的分布。ABCDFigure6（A）覆盖修饰物的等离子增强AgNPs原理图，被细胞内吞的颗粒被保护，而外部的则被刻蚀溶液去除掉，失去了等离子增强作用；（B）细胞内颗粒聚集呈现黄色，外部是绿色，通过刻蚀后外部显著减少；（C）去除多余荧光点后，可以清晰的对颗粒进行细胞内示踪，在220ns时有明显的融合；（D）可对修饰不同染色剂的颗粒分别显示其在肿瘤细胞内的分布。Ock等人16使用无标记SERS和活细胞成像技术来研究嘌呤类似物（抗白血病和抗肿瘤药物）的释放。如图Figure7所示，巯基嘌呤（例如抗白血病的6MP和抗肿瘤的6TG）初始吸附在AuNPs上，之后被谷胱甘肽（GSH）替换，导致对应的SERS强度下降，这可被用于监控药物从NP表面释放的过程。之后使用三肽（甲基代替巯基）作为对照组，通过观察曲线，6TG的SERS特征峰强度在GSH-OEt注射后下降，但是对照组三肽没有显示出显著的影响，可知GSH调控是该药物的给药机理。Figure7（A）GSH-调控的吸附在AuNPs上的巯嘌呤类药物释放；（B）依赖GSH浓度的SERS6MP5强度。三肽对照组显示在SERS强度上没有变化。（C）在体6TG吸附在AuNPs上的SERS光谱在和GSH作用后以及没有GSH时对比图。通过使用SERS/荧光成像光谱学，单细胞抗癌药物释放和传输过程能被精确研究。图Figure8展示了pH控制的给药系统17：阿霉素（DOX）连接AuNP通过pH敏感的腙键连接。当DOX连接后，SERS可测得，而没有荧光。一旦其被细胞吞入，腙键会由于溶酶体的酸性pH而断裂，药物释放。一旦DOX分子从AuNP上脱落，SERS显著减少，荧光可见。因此，等离子增强拉曼信号和荧光的耦合能够实时追踪DOX药物从AuNP上释放和后续进入溶酶体的过程。Figure8（A）AuNPs使用抗癌药阿霉素（DOX）修饰是pH敏感的氨键（用红色标注出）。（B）pH激发的药物释放原理图表明SERS光谱和荧光信号从DOX分子上发出。此外也可利用等离子共振增强来提高药物的治疗效果。Shao等人18为了增强肿瘤光热治疗的效果，采用轻微胶状聚集的纳米颗粒聚合物，此时的等离子共振主要集中在红外区域，可以使用近红外光作为光热治疗的发射光，由于组织（尤其是血细胞）对近红外光的吸收强度极弱，同时聚集颗粒在此波长处的吸收度要高于分散单颗粒，因此可以充分利用光提高光热治疗的效果。Ekaterina等人19使用颗粒靶向定位到肿瘤细胞形成聚合物，等离子共振的光波较长，通过低能量的激光照射即可生成大尺寸的含有致死因子的等离子纳米泡，随后的爆炸除了会导致肿瘤细胞的机械性破坏，还会释放出致死因子使肿瘤细胞死亡，而没有靶向聚集的颗粒则由于分散较好而共振波较短，需要较大能量才能形成气泡，而对正常细胞产生较少副作用。3.细胞组织成像哺乳类动物细胞组织SERS检测和成像。在体检测中使用外部SERS标记为了可以在复杂环境中获得突出信号，并且和特异生物分子连接。很多在生理环境中使用