米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的测定

1/8实验报告课程名称：农产品检测与农化分析实验指导老师：金崇伟成绩：__________________实验名称：米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的测定同组学生姓名：余慧珍一、实验目的和要求二、实验内容和原理三、实验材料与试剂四、实验器材与仪器五、操作方法和实验步骤六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析八、讨论、心得一、实验目的和要求1.掌握米粉中粗蛋白含量的测定方法——半微量消煮蒸馏法；2.了解凯氏定氮法与其他测定方法的区别；3.掌握油料作物粗脂肪的测定方法，熟悉与掌握重量分析的基本操作；4.了解实验中粗脂肪测定所采用的方法和优缺点。二、实验内容和原理1.米粉中粗蛋白测定意义米粉是我国目前消费量和消耗大米量最大的大米深加工产品,但目前国内米粉生产技术较低，米粉品质尤其是粗蛋白含量随产品变异较大，因此米粉中粗蛋白的测定对米粉标准化、工业化、规范化生产具有重要意义[1]。2.粗蛋白测定——硫酸过氧化氢-半微量蒸馏法2.1待测液制备——硫酸-过氧化氢消化法浓硫酸是一种强氧化剂，也是一种脱水剂，在反应过程中还起到升温的作用。过氧化氢是一种氧化剂。米粉在浓H2SO4溶液中，历经脱水炭化、氧化等一系列作用，而氧化剂H2O2在热浓H2SO4溶液中分解出的新生态氧具有强烈的氧化作用，分解H2SO4没有破坏的有机物和碳。使有机氮转化为硫酸铵盐，该消煮液可用半微量蒸馏法定氮[2]。反应过程：NH2-R-COOH+H2SO4→nCO2+SO2+H2O+NH3；2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4。2.2粗蛋白含量测定——半微量蒸馏法消煮液中的硫酸铵经强碱（如30%-40%的氢氧化钠）碱化使之分解放出暗器，利用蒸汽将氨气蒸至硼酸溶液中被吸收，氨与硼酸溶液中的氢离子结合生成铵根离子，使溶液中的氢离子浓度下降。用标准酸液滴定，利用标准酸液消耗体积及其浓度可计算得到标准酸液消耗量，对应反应方程可计算求出NH4+含量，进一步求出米粉粗蛋白含量[2]。1)蒸馏过程：(NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2NH3↑+2H2O2)吸收过程：NH3·H2O+H2BO3→NH3·H2BO3+H2O3)滴定过程：2NH3·H2BO3+H2SO4→(NH4)2SO4+2H2BO3。专业：农资1202姓名：平帆学号：3120100152日期：2015.6.19地点：农生环B249装订线2/82.3粗蛋白含量计算公式粗蛋白含量（%）=(V-V0)×c×14×10-3×ts×K×100m其中，V——样品测定所消耗1/2H2SO4的体积（mL）；V0——空白试验所消耗的1/2H2SO4的体积（mL）；c——标准的1/2H2SO4浓度(mol/L)；14——氮原子的摩尔质量（g/mol）；10-3——mL换算为L；ts——分取倍数，本实验为ts=10；m——样品质量（g，干基）；K——氮换算成蛋白质的系数，本实验为K=5.95。3.粗脂肪测定意义脂肪是粮食、油料中的重要化学成分。测定粮食、油料中的粗脂肪含量，对评定其可食部品质和营养价值具有重要意义。对油料作物如油菜、花生等而言，含油量的高低直接体现了其经济价值；同时含油量高低又是确定油料等级的重要依据[3]。本实验中提取的脂肪性物质为脂肪类物质的混合物，其中含有脂肪游离脂肪酸、磷脂\酯、固醇、芳香油某些色素及有机酸等，称为粗脂肪。4.油菜粗脂肪含量测定——残余重量法4.1残余重量法本实验采用重量法，对提取前的样品和用脂肪溶剂提起后的脂肪进行称量，通过质量差值计算油脂含量，该法适用于固体和液体样品。通常将样品浸于脂肪溶剂，为乙醚或沸点30℃至60℃的石油醚，借助于索氏提取器（图1）进行循环抽提[2]：4.2粗脂肪含量计算公式粗脂肪含量（%）=（m1+m2-m3）/m2×100%其中，m1----滤纸的质量(g)；m2----滤纸及烘干样品的质量(g)；m3----浸提后的滤纸及残渣的质量(g)。三、实验器材与仪器1．样品市售米粉；油菜籽；2.试剂乙醚或石油醚、浓H2SO4（密度1.84g/mL）溶液、H2O2溶液、NaOH溶液、甲基红（含乙醇）-溴甲酚绿混合指示剂、H3BO3指示剂、（1/2H2SO4）标准液；3.器材2.1粗蛋白测定万分之一分析天平、消煮炉、消煮管、半微量定氮蒸馏装置、半微量滴定管（5mL）、锥形瓶、容量瓶、移液管、洗耳球；图1索氏提取器3/82.2粗脂肪测定万分之一分析天平、高温鼓风烘箱、称量瓶、药匙、滤纸、分析天平、毛玻璃板、脱脂棉、索氏提取器。四、操作方法和实验步骤1.米粉中粗蛋白含量测定1.1待测液制备1.2半微量蒸馏法测定2.油菜中粗脂肪含量测定2.1样品处理2.2样品抽提测定取米粉0.25xxg于100mL消煮管中；加浓硫酸5mL，轻轻摇匀于瓶口处放置一个弯颈漏斗，在消化炉上文火加热；待浓H2SO4分解冒白烟逐渐升高温度溶液全部呈棕黑色，取下消煮管，静置冷却后滴加H2O2约10d，不断震摇取出消煮管冷却，少量水冲洗小漏斗重复操作至试管溶液呈现清亮色，加热至微沸10-20min，稍冷后在加热5-10min，以除尽过剩的H2O2消煮液用蒸馏水定容至100mL，取上清液测定含氮量。同时，消煮时应同时做空白试验以校正试剂。蒸馏前，洗净蒸馏装置，先检查蒸馏装置气密性；移液管移取澄清待测液10mL于蒸馏器中接液锥形瓶中加H3BO3指示剂混合液10mL向蒸馏室内缓慢加入10mol/LNaOH溶液20mL，通入蒸汽待馏出液体积约为50mL时，即蒸馏完毕用少量以调节至pH=4.5的水洗涤冷凝管的末端用0.0103mol/L（1/2H2SO4）标准溶液滴定馏出液由蓝绿色至刚刚变为紫红色，记录所用酸标准溶液的体积V（mL）和空白测定所用的酸的标准体积V0（mL）折叠滤纸包（不封口），用铅笔编号，烘干至恒重（m1）称取经105℃烘干1h后粉碎试样m2（约1g）全部移入滤纸包中，封口将样品包有顺序地装入抽提筒中，抽筒内最多放40包在抽提瓶中放入几粒玻璃或浮石，连接好抽提器，倒入无水石油醚至出现虹吸作用止，再倒入无水石油醚并保持在超过样品的高度，使其完全浸泡样品连接好冷凝管，接通冷凝水，在55℃水浴锅上加温进行抽提，连续抽提6-8h抽提完毕，放出抽提筒中的石油醚，取出样包，放在通风柜内晾干；放入105℃±2°烘箱中干燥3小时，取出放入干燥器冷却至室温，称重，直至恒重（m3）4/8五、实验数据记录和处理表1米粉中粗蛋白含量的测定样品质量m(g)滴定后体积V(ml)滴定前体积V0(ml)稀释倍数ts换算系数K硫酸浓度c(mol/L)米粉中粗蛋白含量（%）实验组0.25061.9800.02105.950.01034.79注：米粉中粗蛋白计算公式含量（%）=(V-V0)×c×14×10-3×ts×K×100m表2油菜中粗脂肪含量的测定滤纸质量m1(g)滤纸及烘干样品质量m2(g)浸提后滤纸及残渣质量m3(g)油菜籽中粗脂肪含量（%）实验组0.59561.62331.595838.38注：油菜籽中粗脂肪计算公式含量（%）=（m1+m2-m3）/m2×100%六、实验结果与分析1.米粉中粗蛋白含量的测定本次实验根据GB50095-2010测定得到米粉中粗蛋白含量为4.79%。据报道[1]，一般市售米粉的粗蛋白含量范围为5.4~7.8%。比较可得，本组测定值较低；而与同一时间测定的其他组比较，其他组测定得粗蛋白含量在4%~6%之间。比较可得，本组测定值较为正常。可能原因是操作误差与米粉品质差异，其中影响米粉粗蛋白的影响因素有原大米蛋白质含量、加工中糊化程度、浸泡中浸泡液pH和离子强度、制粉中干磨强度等[5]。而实验中误差可能原因与改进如下：1.1误差实验中误差的可能原因有：1)本组在将米粉移如消煮管中，有少许粘附在侧壁上，导致之后的消煮始终无法将在粘附在最上端的米粉溶下，而导致消煮所得待测液中NH4+浓度较低，从而使得粗蛋白测定结果偏低；2)蒸馏过程中，如NaOH未加过量、蒸馏装置接头处有漏气导致NH3溢出，或蒸馏时间不够（本次蒸馏终点仅以锥形瓶中溶液达到50mL为标准），由此导致的NH3未完全被吸收均会导致粗蛋白测定结果偏低；3）由于是实验操作考试，本实验未设空白对照组，因此在计算结果时，除加加入米粉之外，消煮前引入的含氮化合物，以及消煮后蒸馏滴定阶段引入的NH4+或NH3均会使得实验结果测定值偏高，本实验中该影响程度不可确定；4）本实验消煮过程开始阶段，消煮温度仅为150℃，远未大浓硫酸微沸的温度。此时过早加入过氧化氢会使得消煮温度始终无法达到理论值；此外，消煮时间过短，反复取放消煮管造成消煮不充分也会使得消煮不完全。这是本实验中粗蛋白含量较低的主要误差来源。5）蒸馏速度过快，或者加热温度过高，碱液容易被蒸汽带出至锥形瓶，导致测定结果偏高；且蒸馏结束拔出入口玻璃塞过快时，会使碱液倒喷入冷凝管，亦导致结果偏高[6]。1.2改进针对以上误差分析，可通过以下方法加以改进：1）往消煮管中加入大米时，宜使用长纸条缓慢送入到硬质试管底部，尽量减少粉末粘在壁上，5/8影响样品的消煮。2）消煮过程中应留意消煮温度，调节加热温度在200~250℃，保证充分的消煮时间。且H2O2滴加第一次不可过早，尽量在等到达到浓硫酸微沸后一段时间再加入，且滴加时需直接滴入瓶底溶液中，避免滴在瓶壁上，否则H2O2会因高温快速分解，失去氧化效果。3）蒸馏过程中NH4+在碱性条件下释放出氨，为防止样液中氨气逸出，在检查好装置气密性的前提下1）加入氢氧化钠溶液需过量；2）缩短待测液的滴加时间，因为操作时间越长，从加入口溢出的NH3越多，使得测定结果越小；3）水封；4）夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽。4）蒸馏过程中为确定蒸馏是否完毕可在液体即将蒸馏完毕时，打开玻璃塞口，用蒸馏水润湿的洁净红色石蕊试纸检验蒸汽中是否存在NH3。此过程操作亦需快速完成。若试纸变红，则说明蒸馏未结束，反之，则可终止蒸馏过程。5）定容和滴定时，需等溶液充分冷却至室温后方可进行，否则由于温度的变化会影响定容的准确性和滴定终点的判断。6）所用的试剂溶液必须用无氨蒸馏水配制，且在转移待测液时尽量避免氨氮的污染。2.食品中粗脂肪含量的测定本次实验根据GB5490-1985测定得到油菜籽中脂肪含量为38.38%，油菜籽中油脂的含量为37.5%~46.3%，且根据油菜的类型不同其油脂含量略有不同[8]。对比可得，本实验测定值在正常范围之内，且与同一时间其他组测定值较为接近。由于本实验中，索氏提取器部分有助教代为操作完成，因此以下分析可能的误差原因，实际状况尚未可知。2.1误差实验中误差原因可能有以下几点：1)烘干样品吸水。经过索氏提取器对油脂进行提取后的纸包要进行烘干，但因烘干与称量时间相隔较久，且当天环境中相对湿度较大，滤纸与油菜籽等吸水导致测定结果偏低；2)提取不完全。多个样品共同提取时，部分脂肪物质没有提取完全，因而导致实验结果偏低：3）烘干冷却时间不一致。且时间过长时，不饱和脂肪酸会因受热氧化而增加质量，导致测定结果偏高[9]。2.2改进1）称量油菜籽样品之后，迅速包好滤纸，加入索氏提取器；或缩短烘干与称量的时间，减少其吸水带来的误差；2）增加单个滤纸包内油菜籽质量，同时单个索氏提取器内加入样品数量，且滤纸包需在保证油菜籽不外漏的前提下，使得乙醚提取液能与其充分接触，提高脂肪提取率；3）保证烘干冷却时间一致，且烘干时间不宜过长。七、讨论、心得问题1粗蛋白含量测定方法之间的比较？目前，粗蛋白的方法主要以传统蒸馏滴定法和仪器自动检测法为主。下面将就强碱直接蒸馏法、双氧水法（本实验采用）、凯氏定氮仪法进行比较。先简要介绍强碱直接蒸馏法和凯氏定氮仪法原理与操作步骤。1.1强碱直接蒸馏法[10]6/8强碱直接蒸馏法是间接测定粗蛋白质的一种简便的方法。其将样品在强碱中消煮，使饲料中的α-氨基、酰氨基以及某些特殊基团上的氮素在强碱的作用下以氨的形式释放出来，直接蒸馏到硼酸中，再用盐酸溶液来滴定，根据盐酸消耗量来计算出DD法所测得的表观含氮量。计算公式与双氧水法类似。1.2凯氏定氮仪法[11]B