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1LPEMS⁄ZYA-43-2011生活饮用水中耐热大肠菌群、总大肠菌群、大肠埃希氏菌的测定——酶底物法一、实验原理该革新的检测技术利用分别由大肠菌群β-半乳糖苷酶及大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶代谢的两种「营养剂─指示剂」：邻硝基苯-β-D-半乳派喃糖（ONPG）及甲基香豆基葡糖醛酸苷（MUG），作为Colilert试剂的主要碳源。1、利用大肠菌群细菌能产生β2半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色，检测大肠菌群；2、利用大肠埃希氏菌产生β2葡萄糖醛酸酶分解MUG使培养液在波长366nm紫外光下产生蓝色荧光，检测大肠埃希氏菌；3、改变培养温度，可检测耐热大肠菌群。因为大多数非─大肠杆菌属菌类没有这些酶，所以无法在Colilert试剂里生长及干涉这些物质。而有这些酶的少数非─大肠杆菌属菌类会受到Colilert特殊配方的基质选择性的抑制作用（专利技术）。二、仪器和试剂耗材1、检测设备—程控定量封口机Quanti-TraySealerModel2X美国IDEXX；2、可充电紫外灯，6W，220V，366nm；3、紫外线防护镜；4、DST酶底物法24小时Colilert试剂美程控定量封口机国IDEXX；5、51孔定量盘（无菌）；97孔定量盘（无菌）6、阳性标准比色瓶，阳性51孔标准比色盘；7、100mL含硫代硫酸钠无菌取样袋/瓶；MUG试剂（科立得）定量盘（51孔或者97孔）取样瓶28.记号笔；9.无菌剪刀；10.无菌夹子；11.一次性医用无菌手套。四、实验步骤1.操作流程图酶底物法即可以作定性又可以作定量分析，同时检测两个指标，总大肠菌群（totalcoli）和大肠埃希氏菌（Escherichiacoli），方法简便，快速，结果准确。2.操作说明注意：如果不按照说明使用机器，可能会有人员伤害、机器损害、其他财产损害以及出现检测结果不准确。（1）操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。（2）打开电源开关，橙黄色指示灯应当亮起。（3）程控定量封口机需要预热直到绿色指示灯亮起（大约10分钟）。只有当两个灯都亮时，才说明机器达到工作温度。（4）大肠菌群、大肠埃希氏菌：取100mL水样加入酶底物试剂1支混匀，转入51孔或97孔定量盘内（注意：在取水样和去定量盘时手不能触碰到含有少3量硫代硫酸钠的无菌取样瓶及定量盘封口处，以免影响检测结果），封口后于36±1℃培养24h，观察结果。耐热大肠菌群：实验同上，但培养温度变为44.5±0.5℃（5）把橡胶垫放到进口托盘架上，有大矩形孔的一头在外。（6）把装有样品和DSTColilert试剂的定量托盘放入橡胶垫中，注意定量托盘的每个凹陷要对准橡胶垫上对应的空。（7）向机器方向轻轻推动橡胶垫，直到机器抓住橡胶垫，并带动其进入机器。（8）大约15秒钟，定量托盘封口完成，从机器后出来。请从机器后拿出橡胶垫和定量托盘。（9）任何时候，如果需要使机器反转，从前面退出橡胶垫（例如当定量托盘没放平就将橡胶垫放入机器），请按反转钮。但是，当橡胶垫已经完全进入机器中，请不要按反转开关。如果有多个橡胶垫，可以连续放入机器。检测结果说明：现象结果比阳性比色对照品的黄色浅总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阴性与阳性比色对照品的黄色相近或更深总大肠菌群为阳性与阳性比色对照品的黄色相近或更深，且在紫外灯下显荧光总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阳性（10）在暗室中，使用6瓦，366nm的紫外灯在距样品15厘米左右的位置观测是否显荧光。（11）结果应在24-28小时内读取。此外，总大肠菌群和大肠埃希氏菌培养时间小于24小时已经为阳性；或总大肠菌群和大肠埃希氏菌大于28小时依然为阴性，则结果也有效。◆注意：1.检测试剂于2—30°避光储存；2.a.使用过的取样统一收集进行灭菌处理；b.橡胶插垫可以放到高压消毒锅中进行消毒，也可以用异丙醇或家用漂白剂清洗。清洗时应注意这些清洗剂的危害。要经常清洗橡胶插垫，确保橡胶插垫上不要有污垢。一般情况下可使用柔软的干布清洗封口机外壳。也可以用异丙醇或家用漂白剂清洗，但要注意个人防护。只有专门指定的人员才可以打开封口机的前挡盖。请参照保养手册，清洗封口机的内部。清洗工作一定要有经过培训的人员来完成。如果有样品从机器中滴4出，请不要打开前挡盖或使得封口机倾斜；3.拿出定量盘后应尽快用无菌夹子夹住袋口，以免剩余定量盘被细菌感染；4.使用后关掉机器；5.技术参数重量规格(cm)周围温度电源16公斤30Hx27Dx39W0-32oC220V,50Hz,3Amp附表：1.51孔定量盘法不同阳性结果的MPN值表2.97孔定量盘法不同阳性结果的MPN值表