糖化酶及其在酒类中的应用.

糖化酶及其在酒类中的应用小组成员：费鹏严姗石勇军董智哲王培培CONTENTS一、前言二、糖化酶的性质三、糖化酶活力测定四、糖化酶的固定化五、糖化酶在酒类酿造中的应用六、前景与展望1糖化酶糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶(GlucoamylaseEC.3.2.1.3.)，又称为淀粉α-1,4葡萄糖苷酶、γ-淀粉酶，是一种含甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白。它的分子量为6万～10万，是糖苷水解酶的的第15族，是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶，以不同的形式存在于不同的菌中。因为在发酵行业中主要用作将淀粉转化为葡萄糖，所以习惯上被称为糖化酶。2糖化酶的分布23个属，35个种。真菌3个属，3个种。细菌人的唾液与动物胰腺其他3糖化酶的结构糖化酶一般包括催化域(catalyticdomain，CD)、淀粉结合域(Starch-bindingdomain，SBD)及连接CD与SBD的O-糖基化连接域(O-gly-cosylatedlinkerdomain)。4糖化酶多型性糖化酶具有多型性，如Rhizopusnivenus可以产生5种活性成分。陈冠军、罗贵民等人从黑曲霉AS3.4309变异株B-11的发酵液中分离出三种电泳均一的糖化酶GⅠ、GⅡ、GⅢ，其中GⅠ、GⅡ能水解糊化的淀粉，但不能水解生淀粉或作用能力非常弱；而GⅢ能够水解生淀粉。这三种成分的相对分子质量、等电点、化学组成、含糖量各异。类型相对分子质量等电点含糖量最适温度GⅠ270003.388.7%70℃GⅡ530003.5918.3%70℃GⅢ670003.5213.6%70℃蛋白质合成的修饰作用不同发酵中受到自身蛋白质水解酶和糖苷酶的作用。基因调控、转录的方式不同。多型性的原因5糖化酶的作用机制2水解α-1,4糖苷键1水解α-1,6糖苷键构型变化,形成β-D-葡萄糖pH稳定性底物特异性1糖化酶的性质热稳定性1糖化酶的热稳定性糖化酶一般对热很稳定，如热硫化氢梭菌（CLostridiumthermohydrosulfuricum）糖化酶至于50%的淀粉溶液中，在70℃下十分稳定，即使在85℃下处理１h其酶活性仍保持50%。真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生的糖化酶耐高温性能优于真菌。2糖化酶的pH稳定性一般糖化酶都具有较窄的pH值适应范围，但最适pH一般为4.5～5.5。3糖化酶的底物特异性其底物亲和性与底物的碳链长度呈线性关系，碳链越长底物亲和力就越大；糖化酶所水解的底物分子越大其水解速度就越快。酶的水解速度还受到底物分子排列上的下一个键影响，邻近α-1,4链的α-1,6糖苷键较独立的α-1,6糖苷键更易被打开。1糖化酶的活力测定电泳活性染色法淀粉底物法1g固体酶粉(或1mL液体酶)于40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉，产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。麦芽糖底物法麦芽糖20g/L，pH4.30，反应温度37℃，反应时间30min下，每分钟裂解1μmol麦芽糖所需酶量为一个酶活力单位U。1淀粉底物法糖化酶从淀粉分子非还原性末端开始，分解葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。2麦芽糖底物法糖化酶水解麦芽糖生成α-D-葡萄糖，在葡萄糖脱氢酶(GlucDH)试剂中加入变构酶可将其转化成β-D-葡萄糖。在GlucDH的作用下，β-D-葡萄糖与NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应生成NADH，后者即等于葡萄糖初始浓度，可用于分光光度法在340nm测定其数值。3电泳活性染色法采用Starch-Page在分离胶中加入淀粉作为糖化酶的作用底物，电泳结束后温浴一定时间，糖化酶所在部位胶板中的淀粉被酶解，其余部分的淀粉依然存在，碘液染色后，糖化酶存在的部位呈现透明区域，且透明度与酶活力成正比，没有被水解的部位则被染成蓝色。其他包埋法共价结合法吸附法交联法酶的固定化1包埋法包埋法是指将糖化酶包埋在凝胶的微小空格内或半透膜的微型胶囊中，载体的孔径不能大于酶分子，以免糖化酶渗出。常用的载体有聚丙烯酰胺、三醋酸纤维、聚乙烯醇等，其中前两者效果最好，而且被广泛使用。研究人载体处理方法酶的性质Demand等三醋酸纤维溶于二氯甲烷的三醋酸纤维和糖化酶在冷冻下混合搅拌制成乳浊液,在甲苯中凝固,得到多孔性的三醋酸纤维包埋的糖化酶。包埋率达90%,稳定性良好,在45℃下作用于30%液化淀粉,得到98%的葡萄糖,工作3个月仍保持原活力。Tanara等海藻酸钙用聚环乙亚胺和30%季胺化的聚环乙亚胺分别处理海藻酸钙，然后用它包埋糖化酶包埋率高,但酶活力只有原来的21%～30%。Thomas聚乙烯醇光化学交联法固定糖化酶于聚乙烯醇表观活力很低2共价结合法共价键结合是指酶的一些官能团如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等以共价键形式与不溶性载体结合。常用载体包括天然高分子(纤维素、淀粉、胶原及衍生物等)、合成高聚物(尼龙、多聚氨基酸等)和无机支持物(多孔玻璃、金属氧化物等)。这种方法的最大优点就是酶和载体结合极其牢固，即使用高浓度的底物或盐类溶液，也不会使酶脱落。最大缺陷是常引起酶蛋白高级结构发生变化，破坏了酶的活性中心。研究人载体处理方法酶的性质Weetall等多孔玻璃先用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷,然后硅烷化,最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶。酶活较高,45℃下能连续生产3个酶半衰期,估计能使用5.3年。黎高翔纤维素对氨基苯磺酰乙基纤维素重氮化物偶联糖化酶酶活力10000u/g载体,相对活力为15%～20%的糖化酶Skinnier等淀粉及衍生物酸性水解淀粉及其衍生物为载体固定糖化酶酸性水解淀粉聚丙烯腈接枝共聚物的酶活最高,失活率最低Stanley甲壳素、戊二醛活力为游离酶的67%3吸附法吸附法是一种较古老的方法，其操作简便，处理条件温和，可回收利用。与共价结合法相比，该法制取的酶高级结构很少发生改变，但与载体结合较差，外界条件变化容易引起酶解析。吸附法也有许多不足，如酶量的选择全凭经验，pH值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同等。因此，其应用受到限制。4交联法交联法是用多功能试剂与酶蛋白之间发生交联，即有酶分子之间的交联，也有一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，可以获得不同物理性质的固定化酶。常用交联试剂有戊二醛、1,5—二氟—2,4—二硝基苯等，一般价格昂贵。此法很少单独使用，一般都将其作为其它方法的辅助手段，以达到更好的固定效果。5其他除采用上述几种方法固定糖化酶外。目前较为先进的就是几种方法的连用、双酶法和超滤膜法。日本学者Fuji等研究表明,α-淀粉酶和糖化酶的混合酶在水解淀粉的过程中具有协同作用,即在混合酶系统中所生成的葡萄糖量是单独使用两种酶所得葡萄糖量的二倍多。这就为淀粉一步转化成葡萄糖奠定了理论基础。超滤膜开始应用于固定化，不但能进行相分离，而且能提供界面接触和酶一起构成表面催化剂，并可制成各种形式的反应器。Darnoko等报道挤压的木薯淀粉在超滤膜反应器中连续糖化2.5h，在55℃下淀粉转化率为97%，产率是间歇式24h操作产率的10~11倍，并且葡萄糖的纯度高。糖化酶的应用范围日益扩大，特别是在食品生产行业中得到了广泛的应用。我国传统酿酒生产大多使用淀粉质原料,以曲为糖化剂，采用固态发酵法,但成本高，出酒率低。糖化酶的应用使粮醅入酵后发酵升温快，幅度大,提高原料的出酒率，缩短发酵周期。1糖化酶在浓香型白酒中的作用彭燕等研究了在浓香型白酒加入TH-AADY和活性酵母对白酒出酒率和品质的影响：结论：添加TH—AADY及糖化酶,使酒醅发酵更彻底、更充分,提高了出酒率。同时，使酵母先占优势,抑制了醋酸菌的生长。醋酸菌都是典型的好气菌,添加TH—AADY及糖化酶(Yes.A)可以保证酒醅入池后,酵母菌迅速繁殖,消耗了氧气,抑制了酒醅中醋酸菌的生长繁殖,从而减少了酒醅中乙酸及乙酸乙酯的生成,使酒中乙酸乙酯含量降低,突出了浓香型酒的主体香——己酸乙酯的特征。在转型时,可以大大缩短转型期。1研究人研究的酒类糖化酶的应用结论覃雪珍湘泉浓香型白酒在混蒸混烧工艺中添加TT-AADY和糖化酶有助于提高己酸乙酯的含量，抑制乙酸乙酯的生成，取得了产量与质量的双赢。王卫国黄酒通过正交试验对糖化酶在黄酒酿造中的影响因素进行了研究出酒率高达92.06%，感官鉴定也得到了优化。赵金松清香型小曲白酒在传统工艺中加入糖化酶淀粉糖化更加彻底，出酒率提高了5%，酒质风味不变，降低成本的同时也得到了更好的经济效益刘子章大曲酒将撒曲步骤改为加糖化酶出酒率提高了4.03%—11.62%，降低了成本，取得了明显的经济效益虽然糖化酶的研究已经进行了多年,但是依然存在许多问题等待解决,糖化酶的研究方向将集中在以下几个方面：特性改良利用酶分子修饰技术、酶的非水相催化技术，促进酶的优化生产和高效应用菌株选育将精确的分子生物学技术应用于菌株选育中固定化提高单位载体的固化酶活性容量,提高其使用寿命,扩大其使用范围优化工艺采用先进的提取工艺和设备使糖化酶既是高纯度、高活力的产品,又符合卫生标准结构性质研究酶学特性,了解结构,热稳定性机理,提高基因的表达水平。1