系统发育分析教程

系统发育分析教程大致流程：1.从18个mtDNA基因组中提取rRNA基因12S、16S和蛋白质基因ND1、ND2、CytB2.分别进行序列比对，并进行比对精制3.将精制比对结果串联成一个独立的分析文件，记录基因位置4.NJ分析(MEGA)5.MP分析(PAUP)6.ML分析（RAXML）7.贝叶斯分析（MRBAYES）1.安装DNASTAR软件（又名Lasergene），软件内包含很多组件。2.例子中有18个转录组的数据，ctrl+A,点住第一个文件拖到DNASTAR的MegAlign里。确保MegAlign左侧的序列名称完全按照英文字母顺序来排。3.双击第一条序列，在出来的选框中选取12S序列，点击NEXT。不断重复，直至将所有物种的12S序列挑出来。4.然后ctrl+A全选，点击OPTION下面的GeneticCodes,选择编码方式，根据基因来选，这里选择VertebrateMito。点击Align下面的ByClustalwMethod等待程序对齐完成。这时的序列应该已经对齐了。5.将结果存为12S.MSF,MSF格式可以同时保存多个序列文件。6.重复2-5步，分别挑出16S、ND1、ND2、CytB，存为相应的名称。7.安装GeneStudioPro软件8.打开GeneStudioPro的SeqVerter软件。点击Importsequences导入序列，保留gaps全选序列，点击右侧Merge为一个Fasta序列。点击Clear清空，如此将所有序列处理完，将文件的后缀改为fas9.将改好名的文件复制入GBlocks的目录底下。10.打开GBlock.exe，输入o,回车输入上一步的文件名，回车输入t,回车，直到第一项t项为所选的序列类型输入g，回车，这时出现了两个文件重命名文件将-gb移动到.fas之前重复此步，将所有序列处理完，注意所选序列类型要正确。检查所有序列是否已切整齐，且为3的倍数。新建一个txt，命名为5genes打开txt，输入：序列类型，序列名称=起始位-终止位，基因按照特定顺序排列打开第一个序列，记录终止位置选择Appendalignment,按之前的顺序将序列全部导入，并记录下每个基因分布，即起始与终止位置，输入txt中将串联好的序列存为5genes.fas用mega打开序列选择分析然后选择核酸序列选择遗传密码选择distances/computeoverallmean选择替代模型为nucleotide/jukes-cantor点击compute遗传距离为0.396，在0x1之间，适合建NJ树选择建NJ树选择对所有位点进行计算，假如蛋白编码的基因第三位替代过饱和，就选择1和2替代模型选择maximumcompositelikelihood这个是默认设置也可以改为另一个，填入之前预测的模型的gamma参数再改bootstrap运行树已建好用seqverter将序列转为nex格式打开paup参数设置外类群设置搜索次数设置bootstrap次数设置brlens次数保存并退出打开paup，载入转换好的序列保存操作命令在操作行逐条输入并运行命令Outgroup外类群Bootstrapnreps=1000keepallContreeDescribetreesSavetreesfrom=1to=1000或者直接打开刚刚做好的参数直接运行，等程序运行完产生了六个文件把树拖进treeview查看查看分数，一致性指数CI完全一致时为1，如果存在趋同进化或平行进化，则接近0.保留指数RI与CI类似。将文件另存为phy4格式准备好phy格式的序列文件和txt格式的注释，复制到RAXML文件夹底下。打开RAXML下的AutoRun.txt文件，修改好相应参数，将后缀名改为bat。参数注解如下：-f功能，选择了a,是最好用的，另外可以选择d，是最快的。-m模型类型，选择了GTRGAMMAI-s序列所在文件名-n后缀，自己设，这里设为5genes-q基因分布所在文件名-#分析10次Pause停止运行Autorun.bat,开始跑数据。假如要分别对密码子的每一位进行独立的分析，如对编码蛋白的基因进行分析，则对基因分布文件进行修改，如改为DNA,ND_1=1753-2671\3DNA,ND_2=1754-2671\3DNA,ND_3=1755-2671\3当程序跑完后，看最好的是哪次的结果。这次最好的结果是第一次run的，可以把结果拖进treeview里查看可以对Autorun进行修改而进行bootstrap，如改为：RAxML-7.0.3-WIN.exe-fa-x12345-p12345-mGTRGAMMAI-s5genes.phy-n5genes_boot50-q5genes.txt-#50Pause程序产生了四个文件标尺0.1较为合适下面开始贝叶斯分析，用bioedit打开5genes.fas点击EXPORT-sequencealighment-nex/paup编辑此文件，查看missing=-;假如为missing=Mgap=-;，则改为missing=-;将注解写在end;后beginmrbayes;charset12S=1-675;charset16S=676-1752;charsetND1=1753-2671;charsetND2=2672-3646;charsetCYTB=3647-4781;partition5P=5:12S,16S,ND1,ND2,CYTB;end;beginmrbayes;setpartition=5P;Prsetapplyto=(all)statefreqpr=dirichlet(1,1,1,1)ratepr=variable;lsetapplyto=(all)nst=6rates=invgamma;unlinkshape=(all)pinvar=(all)statefreq=(all)revmat=(all);end;beginmrbayes;mcmcngen=10000000nruns=2temp=0.2samplefreq=1000printfreq=1000;end;下面为注解Charset基因片段Prset先验，认为每种一样Lsetlikelyhood怎么设，all是所有partition分开，nst=6是GTR模型Unlike所有模型非关联化Mcmc加热，ngen为走多少步，nchains=4为默认值，可省略。在mcmc后加p可调出之前的数据，nrun为同时进行几个线程，最多为8个。Samplefreq为多少步确认一次Printfreq为多少步显示一次中括号为冷链，小括号为热链。运行mrbayes，输入execute5genes.nex当deviation为0，则两个结果一样，否则则不一样等待程序跑完，输入sumtburnin=50这个值一般是所跑的四分之一。最后生成一致树，用treeview打开，0.95较为可靠。打开tracer，导入p文件。P文件是模型，t文件是树。ESS小于100不可信，大于100可接受，大于200较为可信，分别为红色，绿色，黑色也可以在tracer中burnin把他们选在一起看图是否有很大差异，再看他们的mean是否一样如上述都一样，则bayes的结果较为可信。