紫外光核黄素交联治疗圆锥角膜的研究进展

紫外光核黄素交联治疗圆锥角膜的研究进展圆锥角膜是一种双侧性、进行性角膜病变，其病因尚未明确，最初认为它是一种常染色体显性遗传病，后来发现它还与胶原发育障碍、内分泌与细胞代谢紊乱、免疫缺陷、变态反应等有关。目前，临床上对于圆锥角膜的主要治疗手段均有各自的局限性。最近几年来，国外研究者发现通过紫外光核黄素诱导交联的方法，可以增加角膜基质的机械强度，阻止圆锥角膜的病理进程，有希望成为圆锥角膜的非手术治疗方法。本文就紫外光黄素交联疗法治疗圆锥角膜的原理、方法和临床应用做一综述。1概述在角膜老化过程中出现胶原纤维变粗和变质硬的现象，被证明是与随年龄增大而出现的胶原分子糖基化有关，受这一现象启发，自20世纪90年代开始，研究人员开始试图利用光或热处理角膜，通过羟基自由基介导的氧化反应以增强基质胶原纤维的强度。另外一个有意义的临床现象是：年轻的糖尿病患者从来不会发生圆锥角膜，即使在少数情况下，圆锥角膜出现在糖尿病发病之前，也会因为糖尿病的出现而病情不再进展，这正是由于糖尿病引起角膜基质内的自发糖基化反应，增强了角膜的强度。基于这些临床发现，德国的一个研究小组最早在20世纪末开始研究如何采用保守治疗来阻止圆锥角膜的病情进展，而避免采用传统的手术疗法。1.1原理角膜的生物力学属性取决于胶原纤维、胶原纤维束和它们的空间结构组成。圆锥角膜患者角膜的机械强度通常是正常值的一半。交联疗法的基本原理是光敏剂核黄素（即维生素B2）在370nm波长紫外光作用下，被激发到三线态，产生以单线态氧为主的活性氧族。活性氧族可以与各种分子发生反应诱导胶原纤维的氨基（团）之间发生化学交联反应（Ⅱ型光化学反应），从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力，370nm正是核黄素的吸收峰波长。1.2操作方法首先除去角膜中央直径为9mm区域的上皮，将溶解于20％右旋糖苷的0.1％核黄素滴加到角膜表面，每3min1次，持续30min，在裂隙灯蓝光照射下，确认紫外光照射前核黄素已经进入前房。用波长为（370±5）nm,辐射度为3mW∕cm2的紫外光照射30min，相当于3.4J的总照射能量，光束的直径控制为9mm。在照射过程中，每5min用核黄素、右旋糖苷和表面麻醉剂冲洗1次角膜表面。照射结束后，抗生素眼膏涂眼，并用浸有0.3％氧氟沙星的绷带型接触镜盖眼，直至角膜上皮愈合。1.3创伤愈合患者在治疗后24－48h会有异物感、烧灼感和流泪，未见其他显著的临床并发症，包括内皮功能障碍、持续性上皮缺损、白内障以及青光眼等。在交联治疗后，角膜上皮荧光素染色阳性，2d后染色消失。治疗后出现角膜水肿及角膜大面积的Haze,直至治疗后第7d才逐渐消失。光学显微镜下可见治疗后第3d角膜基质出现凋亡细胞，具有典型的凋亡小体和核碎片。角膜基质显著水肿增厚，全角膜厚度与正常相比增加100%以上。上皮愈合很快，仅在临近上皮层的浅基质有轻度的炎性细胞浸润，可见散在的多形核白细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等。第7d角膜水肿消失，基质细胞数量开始增加，可见基质细胞有丝分裂象，在临近的未接受交联治疗的区域可见较大的纺锤形成纤维细胞。治疗后第4周，由于基质细胞的增生，全层角膜基质基本恢复正常，但是在浅层基质，仍可以发现基质细胞密度降低，甚至存在某些无基质细胞的区域。第6周，角膜基质内的细胞分布恢复至接近正常。免疫组织化学检测发现在治疗后第4周和第6周，在临近治疗区的角膜基质内有a平滑肌肌动蛋白的表达。2紫外光核黄素角膜交联引起的生物学效应2.1生物力学改变紫外光核黄素可明显引起角膜机械强度的增加。Kohlhaas等和Wollensak等对猪眼和人眼进行紫外光核黄素交联后，观察其应力应变行为的改变，发现在一定应力下角膜紧张度提高了5％，此现象仅出现在前部角膜基质，后部基质并未出现显著改变。原因在于65％－70％的紫外光被表层200um角膜基质所吸收，因此深层结构和内皮层很少受影响。2.2超微结构改变Wollensak等对紫外光核黄素引起角膜硬度增加的机制进行研究。对新西兰大白兔进行角膜交联治疗4h后处死取角膜制作超薄切片，在电镜下观察角膜各部分胶原纤维直径比未处理的对侧眼增加12.2％，后部角膜基质（350um浓度）的胶原纤维直径比未处理的对侧眼增加4.6％。而且，在同一只治疗眼，前部基质胶原纤维直径比后部基质增加9.3％。这一超微结构的改变正是交联疗法提高角膜机械强度的解剖学基础，而胶原纤维直径增粗在前部基质更为显著，与紫外光通过基质时迅速衰减和核黄素吸收紫外光主要在前部基质有关。2.3水合作用的改变Wollensak等将经过紫外光核黄素交联的猪眼角膜放进湿房24h观察角膜基质的水合作用，发现角膜根据水肿程度明显分为3个条带的区域，交联程度越高，水肿程度越低，最前方是交联最强的部分，然后是中度交联的部分，最后是未交联部分。2.4生物学活性的改变研究发现，经过紫外光核黄素交联的角膜对抗各种酶消化作用的能力显著加强。经过胃蛋白酶、胶原酶和胰蛋白酶对角膜的作有后，交联后的角膜分别在第13、14和第5d出现溶解，而未经过处理角膜分别在第6、6、2d出现溶解。提示紫外光核黄素交联疗法或许可以应用于角膜溃疡的治疗，因为角膜溃疡中各种组织降解酶在病情发展中发挥了重要的作用，如果可以增强角膜组织对抗酶消化作用的能力，无疑可以延缓组织溃疡的发展。3安全性问题紫外光核黄素交联疗法可能带来的不良反应主要包括两个方面：紫外光照射带来的直接损伤和紫外光的光化学效应带来的角膜损伤。紫外光直接损伤取决于波长、辐射度和照射时间，而间接损伤是由紫外光激发核黄素产生的自由基造成的。3.1对角膜基质和内皮细胞的影响Wollensak等研究了紫外光核黄素交联对角膜基质细胞和内皮细胞的操作作用，发现兔眼以过交联治疗24h后，在深达300um的角膜基质出现了细胞凋亡，且细胞凋亡的深度与辐射的强度呈正相关。对体外培养的猪角膜基质细胞的研究发现，在有0.025％核黄素溶液存在的情况下，紫外光照射引起细胞损伤的域值是0.45mW∕cm2，而单独用紫外光照射时引起损伤的域值是这一数值的10倍。对临床接受交联治疗的患者进行共聚焦显微镜观察发现，表层270－350um的角膜基质出现细胞死亡，但在交联6个月后，基质内细胞数量又重新恢复正常。另一临床研究发现，在交联治疗后最早2周左右，可以发现在角膜300um处存在分界线，表示浅层交联区与深层未交联区的界限，这可以作为一个观测在整个交联浓度的指标。通过红外温度始终保持相对稳定，在引起热损伤的域值温度始终保持相对稳定，在引起热损伤的域值温度之下，因此可以排除由交联治疗引起的角膜胶原的热损伤。3.2对晶状体的影响紫外线已经被证实是引起白内障的原因之一。紫外光核黄素交联治疗是否会引起医源性白内障？动物实验和临床都排除了这一并发症的发生。可能的原因是用于交联治疗的紫外光能很小，约0.65J／cm2（0.36mW∕cm2），远远低于可以引起白内障的能量水平70J／cm2.另外在交联疗法中使用的是A波紫外光（UVA），而引起白内障的主要是波长290－320nm的B波紫外光（UVB）。3．3对视网膜的影响引起视网膜热或光学损伤的波长在400－1400nm，引起损伤的最小辐射强度是4.3mW∕cm2，由于大部分紫外光以过角膜后被角膜基质和核黄素吸收，能达到视网膜的辐射能量已经很小，实验研究未发现交联疗法对视网膜产生损害。为了保证紫外光核黄素交联疗法应用于临床的安全性，必须严格遵照下面几个条件：必须将角膜上皮去掉，以保证核黄素能够扩散进入角膜表面最少30min（在交联过程中，核黄素不仅是光敏剂，也是紫外光的阻挡物）；紫外光辐射度为3mW∕cm2，紫外光必须为单一波长370nm；接受交联治疗的角膜厚度必须在400um以上，以确保角膜内皮不受损害。4紫外光核黄素交联疗法的临床应用德国进行的一项临床研究，对22例23眼中重度圆锥角膜进行了交联治疗，治疗后随访3个月至4年，发现所有以过治疗的圆锥角膜都停止了进一步发展，16眼（70％）角膜屈光力下降2D，屈光不正下降1.14D.所以治疗眼均未出现角膜和晶状体透明度改变，角膜内皮细胞密度和眼压均未出现显著改变，15眼（65％）的视力获得轻度提高，平均提高1.26行。2004年对10例双眼进行性圆锥角膜的患者进行利用紫外光核黄素交联治疗的临床研究，其中一眼作为交联治疗的对象，而另一眼作为对照，治疗后配戴软性角膜接触镜。术后1、2、3、6个月，对治疗眼和对照眼进行了示矫正视力、最佳矫正视力、角膜地形图、结果显示，裸眼视力平均提高3.6行，最佳矫正视力提高1.66行，角膜地形图显示角膜表面对称性提高，彗差减小，内皮细胞计数和眼压无明显改变。除了用于治疗圆锥角膜之外，此外光核黄素交联疗法还可以应用于医源性角膜扩张的预防性治疗或术后治疗，如准分子激光原位角膜磨镶术引起的角膜扩张。另外，该治疗法还可用于角膜溶解性病变或角膜浅层溃疡的治疗，研究证实交联治疗后可以显著提高角膜对各种降解酶的抵抗作用，但首先需要检测剩余的角膜厚度，只有在大于400um时才考虑此疗法，因为吸有足够的角膜基质厚度才可以保证角膜内皮细胞有治疗过程中不受损伤。