紫外可见分光光度技术.

紫外-可见分光光度技术设备可移动机械狭缝型分光光度计二级管阵列型分光光度计可移动机械狭缝型分光光度计光源单色器检测器光源紫外光区（180-400nm）用氘灯400nm以上的可见光区用钨灯市场上也有采用卤素灯的产品单色器从混合光获得单色光的光学元件通常用棱镜或衍射光栅作为光的色散元件然后通过狭缝结构获得波长范围尽可能狭窄（如约1nm）的单色光束通过狭缝结构的移动可以选择不同波长的单色光检测器接受单色透射光的元件由光电倍增管构成它可以接受光信号，并将透射光的强度转换成电信号。模拟信号（Analogsignal）数字信号（Digitalsignal）以透射光强度的变化作为波长的函数得到的平面图既吸收光谱，或称扫描图。双光束型分光光度计其光源产生的两束光同时通过样品池与参比池这两个透射光束之间强度的差别则反映了样品吸收光的强度。单光束分光光度计单一光束通过样品池。如果用这种仪器进行定量分析，在将样品池放入光束中读出其吸收值之前，必须将只含溶剂的参比池放入光束中，通过调整使其光吸收值为零来进行校准。结构光源狭缝棱镜狭缝样品池入射光透射光光电倍增管信号记录光源狭缝棱镜狭缝样品池入射光透射光光电倍增管二级管阵列型分光光度计一种依靠光电二级管阵列（PhotodiodeArray，PDA）采集光信号的分光光度计。工作原理光源整个光谱范围的光全部穿过样品然后将透射光色散经过色散的全波长的光同时落在光电二级管阵列上任何非常狭窄的波带被置于适当位置上的各个二级管接受，并转换成电信号。同时收集所有光电二极管输出的信号可在非常短的时间（微秒）内记录样品的全波程吸收光谱。意义PDA的出现是对紫外—可见吸收光谱技术来说，是一个革命性的突破。它最突出的优点是可以迅速提供被检测组分在一定波长范围内的扫描图。结构光源狭缝棱镜样品池入射光透射光光电二极管阵列光源狭缝棱镜样品池入射光透射光光电二极管阵列仪器参数波长范围带宽量程基线漂移……仪器的校正光源波长吸光度比色杯光源校正发射能量的降低狭缝的调节—单色性波长的校正紫外光区—无水乙醇：229.2nm233.9nm238.9nm243.3nm248.5nm260.6nm268.4nm吸光度的校正确定化合物确定浓度不同波长不同吸光度比色杯的校正不同杯的比较测量条件的选择波长狭缝量程定性分析光谱特征最大吸收峰峰形细微结构……定性结论归纳推理-0.100.100.300.500.700.90250300350400450500550Wavelength[nm]Response[V]0IIIII化合物纯度的鉴定类胡萝卜素顺式异构体……-0.100.100.300.500.700.901.10262282302322342362382402422442462482502522542Wavelength[nm]Relativeresponse15Z-beta-caroteneall-E-beta-carotene结构推断原子吸收光谱E原子=E电子电子跃迁=能量吸收原子吸收光谱分子吸收光谱E分子=E电子+E震动+E转动分子能及跃迁=能量吸收分子吸收光谱分子吸收光谱电子吸收光谱—紫外—可见震动吸收光谱—红外转动吸收光谱—远红外电子吸收光谱（UV-VIS）分子的外层电子跃迁造成的吸收光谱成键电子非键电子反键电子（能级最高）分子的外层电子跃迁s（sigma）-s*n-s*n-p*p-p*s-s*跃迁s*反键轨道200nm真空紫外区饱和烷烃甲烷：125nm乙烷：135nm……n-s*跃迁n-电子：非键轨道电子=孤对电子跃迁能s-s*跃迁能150-250nm摩尔吸光系数：100-300饱和烃类n-p*和p-p*跃迁n电子和p电子比较容易激发200nm不饱和官能团—含有p键-生色团n-p*跃迁：摩尔吸光系数=10-100p-p*跃迁：摩尔吸光系数=1000-10000单个不饱和官能团：摩尔吸光系数=104n-p*和p-p*跃迁溶剂极性增加：n-p*跃迁：紫移p-p*跃迁：红移定量分析根据Beer-Lambert定律，样品液(y毫升)中样品的量x毫克能由下列公式计算：x=(A×y×1000)/(A1%1cm×100)A1%cm的定义为在1厘米光程长的比色杯中1%（W/V）浓度溶质的理论吸收值。定量分析比色内标外标—标准曲线外界条件对光谱的影响溶剂环境的影响温度的影响存在状态的影响游离态复合态溶剂环境分子能级跃迁的能量与溶剂的折射率有关当溶剂的折射率增加时，光谱会发生红移。当溶剂的折射率降低时，光谱会发生紫移。类胡萝卜素在不同溶剂中的λmax值溶剂红移(nm)hexanelightpetroleumethanoldiethyletheracetonitrileacetonechloroformdichloroformbenzenetoluenepyridinecarbondisulphide000002-610-2010-2018-2418-2418-2430-40水的影响当含水量达到30－50%时，类胡萝卜素的光谱会出现一个新的强吸收峰，而通常的主吸收带的强度会减弱。新峰的位置通常在紫外区番茄红素：354nm叶黄素：370nm玉米黄素：380nm这个峰通常相当窄，并且无精细结构。温度的影响在低温下，分子的紫外－可见光谱形状可能会发生根本性变化。10-40nm的红移光谱精细结构的改变通常还会伴随有新的吸收带出现。但光谱曲线下的总面积并未显著改变。。存在状态的影响游离态结合态蛋白质的影响当类胡萝卜素与脂结合时，可能引起其吸收光谱的红移。类胡萝卜素-蛋白质复合体：引起λmax发生极大的红移（有时可能达到约150nm）。