紫菜转录基因组学的研究进展

紫菜转录基因组学的研究进展1.前言紫菜在分类学上隶属于原红藻纲(Protoflorideophyceae)或称红毛菜纲(Bangiophyceae)，红毛菜目(Bangiales)，红毛菜科(Bangiaceae)。目前，已经确认的物种有117个()，常见种类包括坛紫菜(Pyropiahaitanensis)和条斑紫菜(Pyropiayezoensis)等(Sahooetal.,2002;Blouinetal.,2011;Sutherlandetal.,2011)。紫菜是一种非常重要的大型经济海藻，全世界紫菜的年净产值约13亿美元（表1）。现代分析技术研究显示，P.yezoensis蛋白质、紫菜多糖含量丰富，而脂肪含量相对很少，其中蛋白质含量高达干重的36%，是一种典型的低脂类营养保健食品(高淑清和单保恩,2004;童冠文,2010)。同时紫菜中丰富的多糖经现代医学药理分析表明，具有降血糖、降血脂、抗病毒、调节免疫、消炎和抗衰老等多种药物功能(周慧萍和陈琼华,1990;Yasukoetal.,1993;肖美添等,2003;王长云和管华诗,2000)。在我国两个主要的栽培品种是P.haitanensis和P.yezoensis，其中P.haitanensis为我国特有种，P.yezoensis每年的产量近7,000t干重，而P.haitanensis则达到55,000t，仅这两种紫菜每年的净产值就达2.6亿美元。P.yezoensis是日本和韩国的主要栽培品种，其年净产值分别达到8.4亿和2.1亿美元。表1紫菜年产量统计表(引自Blouinetal.,2011)国家种类总产量（吨（干重）/年）总产值（国家）20002002200420062008日本P.yezoensis29,03632,05925,62029,83225,8858.41亿美元韩国P.yezoensis13,04821,00022,85521,75622,4242.09亿美元中国P.yezoensis3,5705,2245,4875,8686,9392.58亿美元P.haitanensis38,33452,41364,91970,87155,071总计83,988110,696118,811128,327110,31913.07亿美元紫菜的生活史由两个世代，即孢子体世代和配子体世代组成，属于异形世代交替，以P.yezoensis为例，其生活史如图1所示。紫菜基因组相对较小（如P.yezoensis仅有3条染色体，约2.6×108bp），种系发生时间短（1-3个月），在实验室对生长发育进行可控调节，相对比较容易获得纯系，且紫菜原生质体的制备技术已经基本成熟(Sahooetal.,2002;汤晓荣等,2006)；同时，由于作为潮间带藻类的紫菜，其生存环境中经受盐度、温度和辐射等环境因子的剧烈变化，使其具有较高的生物学抗逆特征；又因为紫菜具有重要的经济价值，使其成为分子生物学，遗传学和基因组学研究的理想模式物种(Sahooetal.,2002)。图1条斑紫菜生活史简图（引自Sahooetal.,2002）随着后基因组学时代的来临，相继出现了以转录组学、蛋白质组学、代谢组学等为代表的各种组学技术,其中转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术(LockhartandWinzeler,2000)。过去十几年中，转录组领域关于藻类的研究工作主要是利用微阵列(Microarray)、表达序列标签(Expresssequencetags,ESTs)等技术来寻找藻类新基因或进行基因表达水平研究，这些研究中多以藻类在胁迫条件下的基因表达为主。同时，随着最新一代测序平台的发展以及市场化运作，以微卫星(Simplesequencerepeats,SSR)技术为代表的新一代测序技术被应用到藻类研究中来。本文重点针对紫菜的转录组学研究进展进行综述，以了解目前紫菜作为模式生物，在转录基因组学方面取得的重要研究成果(Kitadeetal.,2008)。2.紫菜的表达序列标签(EST)研究藻类的表达序列标签(EST)研究工作一直是热点，也获得了较丰富的研究成果。其中对于紫菜的研究工作开展也较多，多数工作集中于紫菜cDNA文库构建及获得了大量的EST信息(NiwaandAruga,2003,2006;Niwaetal.,2005,2008)，以下选取近年来典型的紫菜EST研究作介绍。为了揭示紫菜生活史的分子调节机制，Asamizu等人构建了P.yezoensis孢子体EST文库，获得了10,625条EST序列，并将获得的孢子体EST与之前NikaidoI等人获得的10,154条配子体EST数据放在一起分析，以鉴定紫菜两个世代中的不同表达基因(Nikadoetal.,2000;Asamizuetal.,2003)。Fan等人(2007)从P.haitanensis孢子体中获得了EST序列5318条，经聚类发现形成非冗余序列2535条，其中仅有32.2%序列（816条）与公共数据库(Nr和KOG数据库)中的序列具有相似性；从功能分类上显示，绝大多数EST都与其保守生物代谢过程相关，并且首次在P.haitanensis中发现可能存在抗氰呼吸(Cyanide-resistantrespiration)及C4途径固碳方式（图2），此外还发现多种与细胞信号转导相关的蛋白及蛋白家族基因，如HSP70家族。密码子分析表明，P.haitanensis在进化过程中可能也经受过高GC片段的压力影响。图2推测P.haitanensis的C4途径固碳方式带有数字标记的框代表确定的基因：EC4.1.1.31：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC);EC2.6.1.1：天门冬氨酸氨基转移酶(AST);EC4.1.1.49：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)3.微阵列技术在紫菜转录组学研究中的应用微阵列(Microarray)技术是开发最早也是目前应用较广的高通量转录组检测技术，但是由于微阵列技术基于杂交技术，因此仅限用于对已知序列进行测定，而无法对新的RNA进行检测(Tautz,1989;LittandLuty1989;祁云霞等,2011)。以往由于藻类序列信息相对缺乏，使得微阵列技术在藻类中的广泛应用进度不大，然而近年来，随着越来越多的藻类物种基因组测序完成，同时，也受益于表达序列(EST)信息的丰富性，使得该技术在藻类领域的应用取得了较好的拓展(Wattier,2000)。由于P.yezoensis的EST信息相对来说比较丰富，周晓君等(2006)选择467个包含P.yezoensis功能基因的基因克隆制备cDNA微阵列，并将cDNA微阵列技术首次应用于紫菜中，以研究P.yezoensis不同世代的基因表达差异性。分析结果显示，配子体中的55个基因表达量上调，其中与已知或推测功能基因相匹配的有21个；孢子体中有86个基因表达量上调，其中24个与已知功能基因相匹配。从而证明经过优化的cDNA微阵列制备技术用于P.yezoensis基因表达分析具有高效性和实用性。4.微卫星技术在紫菜转录组学研究中的应用微卫星（MicrosatelliteDNA），又称为简单重复序列(Simplesequencerepeats,SSR)，是由2-6个碱基排列构成的基序，通过重复串联起来形成的DNA序列，由于重复次数的不同，能够形成多个不同的等位基因位点(LiuandLuty,1989;Tautz,1989;Huetal.,2007,2010)。由于重复序列的侧翼序列的相对保守性，我们就可以通过侧翼序列进行引物设计，采用PCR对目的位点进行特异性扩增，并将扩增出的片段根据长度的不同用于分子标记的开发(张增翠和侯喜林,2004;刘必谦等,2005)。由于SSR位点在基因组中含量丰富且分布均匀，利用SSR作为分子标记物对生物样品进行调查时，能够真实准确的反映出生物遗传多样性(田之海,2013)。SSR位点在真核生物基因组中分布均匀，大豆、水稻和玉米的EST数据中SSR位点数为1~3个/10kb，而在白杨和棉花EST数据中SSR位点数为1个/14~20kb；关于P.yezoensis转录组重复序列的报道中SSR位点数为1个/11.6kb，SSR位点丰富度适中(Yangetal.,2011)。同时，分子标记技术在紫菜中的研究也得以广泛开展。Kong等(2009)人利用SSR标记技术研究了11个来自于不同点位的P.yezoensis品系遗传多样性；同时，有学者利用SSR分子标记技术研究P.haitanensis的减数分裂，研究认为壳孢子萌发形成的两个细胞再次分裂时进行减数分裂(YanandHuang,2010)。Xie等人（2010）利用SSR和SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism)技术构建了覆盖度为88.1%的P.haitanensis遗传连锁图谱，为紫菜的高密度遗传连锁图谱构建奠定了良好的基础。姚继承(2004)利用从GeneBank数据库中获得到的3个SSR位点，以及利用小片文库筛选出来的2个SSR，对2种P.yezoensis和7种P.haitanensis（7个紫菜品系）进行遗传分析。其中，P.haitanensis在不同海区、不同品系与野生样品间存在较大的遗传差异性；而两种P.yezoensis品系间的遗传相似系数达到90.3%，P.yezoensis和P.yezoensis间的遗传相似系数在35.5%-64.5%之间。刘必谦(2005)从P.yezoensis的EST中找到了211个SSR位点，并从这些SSR位点获得了15对引物，成功将其中的13对引物用于P.yezoensisSSR的扩增中，上述结论显示两个紫菜种间SSR具有较高的同源性。Sun(2006)也在EST数据库中获得了391个SSR位点，发现了41对能有效扩增出条带的引物，并且将这些引物用于多个紫菜品系的遗传多样性分析，并构建了紫菜品系的系统进化树。于一(2010)利用富集文库法构建了P.yezoensis和P.yezoensis富含(GA)和(CA)的基因组文库，并采用PCR检测和原位杂交技术，筛选出了62个含有SSR的阳性克隆。杨惠(2011)首次利用富集筛库法从P.yezoensis中获得24个SSR位点，并利用其中的12对具有多态性的SSR位点对青岛的野生P.yezoensis进行遗传评估，得到了29个等位基因；随后利用全部的24个SSR位点分析了11株来自不同地域的P.yezoensis丝状体，其中11个P.yezoensis的遗传距离是0.05-0.35，聚类结果明显将11个个体分为了两支。5.结语转录组学研究的首要前提是获得大量的序列数据，尽管目前其他藻类的序列信息片段化仍十分严重，许多群体在分子水平上还知之甚少，但紫菜作为分子生物学与基因组学中的模式生物，已经在转录组学的研究中取得了重多成果。由于紫菜种类的多样化以及在遗传变异上所具有的特异性，针对紫菜的研究工作仍旧艰巨，但伴随着新一代测序技术的兴起，研究手段的多样化，一定能够促进紫菜的转录组学的研究工作。同时，高通量测序技术的深度发展，使得研究获得的信息量也正以几何级数增长，如何处理庞大数据量所带来的信息学难题，更好地诠释、比对和鉴定多个类似的同源基因，确定最佳测序量、获得高质量的转录图谱等难题有待进一步研究。随着紫菜产业的蓬勃发展，以转录组学为代表的生物技术在其中的应用将更为广泛，这些研究不但是对紫菜生物学的研究需要，同时也是紫菜生物产业化中必须解决的上游技术问题，在未来这些研究工作必将为人类解决食品安全问题提供坚实保障。AsamizuE,NakajimaM,KitadeY,SagaN,NakamuraY,TabataS.ComparisonofRNAexpressionprofilesbetweenthetwogenerationsofPorphyrayezoensis(Rhodophyta),bas