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编号：FAL-YZ-005.1R2A培养基适用性验证报告编制/日期审核/日期评审会签姓名部门职务评审意见日期批准/日期科技发展有限公司目录序号内容页号1目的32范围33依据34职责权限35验证方法35.2验证内容和结果3－85.3验证结论96附件10-12第3页共12页R2A培养基适用性验证报告1.目的因2015版药典纯化水检验用培养基变更,依1105非无菌产品微生物限度检查方法,通过此次实验对所更换的R2A琼脂培养基进行适用性检查，以证明该方法及所采用的培养基适用于纯化水微生物限度检查日常检测。2.范围适用于本公司纯化水的微生物限度检查。3．依据中华人民共和国药典（2015年版）4.职责权限姓名部门分工职责组长：组织确认或验证工作，批准方案和报告负责编制方案、实施、总结报告及微生物检测负责设备样品提供,配合实施方案的工作负责微生物检测5.验证方法5.1R2A培养基的适用性检查5.1.1R2A培养基应进行培养基的适用性检查。5.1.2菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代,试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。5.1.3菌液制备铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的微生物培养基质控品,使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后,在漩涡混合器上振荡混匀,制成1ml(相当于10～第4页共12页100cfu/0.1ml)菌悬液。5.1.4适用性检查取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌各10～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注R2A琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养不少于5天，计数；5.1.5结果判定被检定的固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。5.1.6实验前的准备5.1.6.1仪器设备设备名称设备编号设备状态压力蒸汽灭菌器10-11-53□未检定□己检定在有效期内激光尘埃粒子计数器Y09-3016□未检定□己检定在有效期内温湿度计JWS-A3□未检定□己检定在有效期内微压差表B10093624□未检定□己检定在有效期内微压差表B10090070□未检定□己检定在有效期内细菌培养箱SPX-100B-Z□未检定□己检定在有效期内霉菌培养箱MLX-150-1□未检定□己检定在有效期内确认人:日期:5.1.6.2操作环境微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。5.1.6.3器具无菌培养皿：（直径90mm）1ml注射器第5页共12页5.2计数方法的验证5.2.1当建立纯化水微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。菌种及菌液制备同计数培养基的适用性检查5.2.2验证方法验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。（1）试验组薄膜过滤法计数时，取1ml纯化水，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入10～100cfu试验菌，过滤，滤膜置于R2A琼脂培养基上。（2）菌液组将相当于10～100cfu/ml菌悬液置于100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤。（3）供试品对照组取1ml纯化水供试液置于100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，过滤，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。5.2.3结果判断在3次独立的平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。5.2.4.试验样品5.2.4.1纯化水5.2.4.2稀释液和试剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5.2.4.3器具无菌培养皿：（直径90mm）一次性注射器第6页共12页5.2.4.4验证用微生物名称及其编号菌株名称编号铜绿假单胞菌CMCC(B)10104枯草芽孢杆菌CMCC（B）635015.2.4.5培养基名称生产商培养基批号有效期琼脂培养基S（R2A琼脂）青岛尼赛欣合生物技术有限公司20151009201810085.2.5验证试验操作5.2.5.1试验菌的制备和稀释铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的微生物培养基质控品,使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后,在漩涡混合器上振荡混匀,制成1ml(相当于10～100cfu/0.1ml)菌悬液.再用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将其稀释制成10～100cfu/ml的菌悬液。5.2.5.2将试验分为3组A样品试验组取纯化水1ml，置于装有PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml的三角烧瓶中或均质袋中，充分振摇1分钟。每张滤膜抽滤100ml的供试液,用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml冲洗滤膜,最后加入10～100cfu试验菌,每株试验菌平行制备2个平皿,按膜过滤法测定其菌数。B菌液组将10-100cfu/ml菌悬液置于装有100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角烧瓶中或均质袋中，充分振摇1分钟。每张滤膜抽滤100ml的供试液通过一张滤膜,平行制备两个.以测定所加的菌数。C供试品对照组取纯化水1ml，置于装有PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲第7页共12页液100ml的三角烧瓶中或均质袋中，充分振摇1分钟。每张滤膜抽滤100ml的供试液,用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml冲洗滤膜，平行制备2个平皿,按膜过滤法计数测定供试品的本底菌数。5.2.5.3培养枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌在30～35℃下培养不少于5天，将点计菌落数。并将结果记录于附件。第8页共12页5.2.6试验结果试验组的菌的回收率接入菌种菌落计数（cfu/皿）回收率试验组供试品对照组菌液组铜绿假单胞菌平均值枯草芽孢杆菌平均值表中：回收率=（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数的值）÷菌液组的平均菌落数×100%。检测人:复核人:复核日期:第9页共12页5.3验证结论5.3.1计数性培养基适用性检查结论:试验组菌落数减去供试品对照组菌落的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判定R2A琼脂培养基的适用性检查符合规定。可用于本公司纯化水微生物限度检查实验。5.3.2校正因子(修正系数)校正因子=1/回收率第10页共12页批号:产品试验组的微生物生长检查记录：菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌菌液组的微生物生长检查记录菌种名称菌液组计数结果（cfu/皿）平均值铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌供试品对照组的微生物生长检查记录供试品供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值12测试人/测试日期：复核人/复核日期：第11页共12页批号:产品试验组的微生物生长检查记录：菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌菌液组的微生物生长检查记录菌种名称菌液组计数结果（cfu/皿）平均值铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌供试品对照组的微生物生长检查记录供试品供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值12测试人/测试日期：复核人/复核日期：第12页共12页批号:产品试验组的微生物生长检查记录：菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌菌液组的微生物生长检查记录菌种名称菌液组计数结果（cfu/皿）平均值铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌供试品对照组的微生物生长检查记录供试品供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值12测试人/测试日期：复核人/复核日期：