园林植物快繁技术

园林植物快繁技术导言1.课程的性质和地位园林抗物快繁技术是林业及园林高新技术管理专业必考的重要专业课程，是一门实践性，综合性很强的技术学科。与植物生理学、园林植物栽培学、苗圃学、市场学、管理学等学科有着密切的关系；与此同时，它也有自身学科的性质，特点，内容及其内在结构，如园林植物快繁的基本概念，基本理论，基本技术构成和应用领域等一系列内容。因此，在学习本课程时要注意力量放在基础知识的学习和应用上，紧密联系实际和有关学科的基础知识，掌握正确的分析问题，解决问题的方法。本课程和其他课程的关系2．使用教材（1）.指定教材陈振光主编园艺植物离体培育学中国农业出版社1991(2).参考书籍白宝璋叶尚红王玉国主编植物生理学中国农业出版社1996陈正峰木本植物组织极其应用高等教育出版社1986曹孜义刘国民主编实用植物组织培养技术教程甘肃科学技术出版社2001生物技术基因工程细胞工程酶工程发酵工程快速繁殖人工种质种质贮藏......种质贮藏白根繁殖种质贮藏天性繁殖种质贮藏嫁接繁殖种质贮藏苗木繁殖种质贮藏有性繁殖抚育管理种质贮藏快速繁殖苗木繁殖园林植物培育2.教材体系根据教材内在的结构和便于学员学习的需要，本教材分为六部分：绪论第一章离体培养的基本操作方法第二章到第五章根据外植体差异而划分的离体培养技术体系第六章到第九章离体培养的基本概论和原理第十章到第二十五章各论部分主要介绍一些有代表性的园艺植物种类离体培养，连同书本附表作为资料供学员参考绪论通过本部分学习，了解植物离体培养学的产生与发展，理解其与其它学科和园艺（园林植物）生产的关系，掌握植物离体培养学的含义。一、园艺植物离体培养学的基本含义1.植物离体培养指通过无菌操作，使植物体的各类结构材料（外植体）接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下，进行离体培养的一套技术与方法，通常称之为植物组织培养式植物的细胞与组织培养。2.离体培养技术体系胚胎培养及以胚胎为基础的培养技术器官及器官原基培养组织培养细胞培养原生质培养及以原生质体为基础的培养技术3.离体培养的应用多种的繁育与脱毒种质资源的贮存细胞次生代谢物质的生产细胞工程和基因工程的生物技术育种遗传学和生物学基础的研究二、园艺植物离体培养学的形成与发展（一）、植物离体培养的渊源及其早期的实践1902年、Haberlandt提出了细胞全能性的观点，并首次进行植物细胞培养实验。（二）、植物离体培养基本技术体系的形成1934年White首次建立了番茄的无性繁殖系1937年White发现B族微生物素和吲保乙酸对离体培养的作用1934—1939年White等人初步建立起植物离体培养的基本方法1943年White发表了第一部植物离体培养专著《植物组织培养手册》又重新提出了细胞全能性。1957年skaog建立了器官分化的激素配比模式。1953年Muir报道了细胞悬浮培养法。（三）园林植物离体培养学科的建立1、完善离体培养技术、探索理论基础1964—1966年诱杀未成熟花粉形成单位体植株。1960年分离番茄动根原生质体获得成功，1978年首先获得了体细胞杂种——“potamato”.植物细胞全能性为基因转化提供方便。2、开拓应用研究生产上应用最广泛，最成功的领域是离体快速繁殖。三、植物离体培养学与园艺科学的关系（一）、离体培养与园艺植物良种繁育学（二）、离体培养与园艺植物育种学（三）、离体培养与园艺植物基础学科第一章离体培养的基本操作方法通过学习，理解和掌握离体培养的基本操作方法包括：一般的材料选取、无菌技术、培养基配置和环境条件调控为园林植物快繁技术打下基础。第一节外植体的选择与处理外植体植物离体培养中的各种接种材料，包括植物体各个器官、组织、细胞和原生质体等。（一）外植体的选择1、选择优良的种质主要的园艺植物选取性优良的种质先特殊的基因型要有明确目的具有一定的代表性2、选择建壮的植株生长建壮的无病虫害的植株正常的器官和组织多年生植物应从成年树上取材3、选择外植体的大小对植体太大易污染太小多形成愈伤组织外植体大小在0.5——1.0cm。4、选取对植体的时期一般按照植物生长的最适时期取材含酚类物特多的植物，应在酚类物含量低的季节取材从种苗圃推算苗期，增殖代数等因数，确定选取外植体的合适时期。5、选择细胞[培养材料通常根据细胞培养的目的选择细胞培养材料多数采用茎类分生组织和胚胎培养的愈伤组织作为细胞培养的起始材料。为了生产次生代谢产物，则选取某次生物质含量高的特定器官或组织。（二）、培养材料的处理1、母株的预处理促使母株的生长带谢活跃方便取材容易灭菌降低污染率2、外植体休眠期的处理通常采用低温或者赤霉药剂进行处理，3、外植体的灭菌进行严格的灭菌林料来源取材部位取材季节第二节培养茎的制备一、培养茎的种类及组成1.培养茎外植体生长的营养物质，通常有两个水平，一是基本培养茎包括大量元素和微量元素，维生素和氨基酸，还有糖和水。二是完全培养茎，即在基本培养的基础上，根据各种不同实验要求，附加一些物质，如各种植物生长调节剂以及其它的复杂有机附加物，外植体生长的营养物质。基本培养茎大量元素+微量元素+维生素+氨基酸+糖+水完全培养茎基本培养茎+植物生长调节剂（有机附加物）2.固体培养茎和液体培养茎的比较固体培养茎设备简单使用方便充分利用培养容器中的养分易选成自我毒害液体培养茎需要一定的设备有利于外植株的生长避免上述固体培养茎的缺点3.常见培养茎配方（参见教材附录2）二、配制培养茎的准备工作（一）、器皿和用具的准备主要器具：烧杯、容量瓶、移液管、滴管、试管器具的准备：清洁烘干（二）、水和药品水原则上用纯水，一般用蒸馏水即可化学药品用分析，纯或化学纯（三）、贮备液的配制1.贮备液的类型大量元素扩大10—50倍微量元素扩大100倍铁盐扩大100倍（FeSO4.7H2O+Na2—EDTA）植物生长调节剂0.5mg/ml2.贮备液的配制分别称量溶解混合储存三、配制培养茎的方法少量蒸馏水溶解蔗糖倒入1000ml容量瓶吸取各种贮备液放入容量瓶定容转移到大烧杯与琼脂加热溶解PH调整分袋灭菌保存备用第二节无菌技术（一）、无菌室无菌室的组成：包括无菌操作室和无菌培养室无菌室的要求：墙壁光滑地面平坦门窗密闭无菌室的灭菌：2％新洁尔灭擦洗75％乙醇喷雾紫外灯照射：定期使用甲醛和高锰酸钾熏蒸（二）、试材和器具的灭菌1.培养茎的灭菌采用高温高压灭菌锅工作压力为1.1kg/c㎡（120℃）保质15—20min注意排尽冷空气灭菌完毕冷却备用2.特殊药品的灭菌高温下易分解和变质的药品过滤除菌：溶液通过孔径为0.20—0.45um的过滤网抽滤除菌：用真空泵产生抽力，使溶液通过过滤网3.器皿（具）灭菌常用干热灭菌法工作条件为160℃/hr注意用牛皮纸等包扎好器皿（具）4.外植体的灭菌（1）75％乙醇润浸和杀菌作用30s（2）氯化汞浓度为0.1％5—10min，无菌水冲洗3—5次（3）次氯酸钠浓度2—10％15—30min，无菌水冲洗3—5次（三）无菌操作1.无菌操作前10min先使超净工作台处于工作状态。2.穿戴好工作衣帽后，用70％酒精檫拭双手个工作台面。操作期间，也应在檫拭数次。3.拨塞前，要用火焰灼热瓶口，用硫酸纸等做瓶盖的，应在火焰附近打开盖子。4.操作时，试管口应略略向下，避免尘埃杀菌落入管内，又便于操作。第四节环境条件的操作（一）光照1.光照时间：12—16hr2.光照强度：1000—5000/x3.光照长短（光源）：日光灯（二）温度一般控制在25±2℃恒温条件下培养（三）湿度瓶内一般可达到100％，避免环境湿度过小，防改瓶内失水（四）汽体避免培养室内存在有氨气体第二章胚胎培养和离体受精通过学习，了解胚珠和子房培养，离体受精的胚胎培养技术，理解和掌握胚培养，胚乳培养的胚胎培养技术。第一节离体胚培养（一）胚培养的意义1.促使发育不良或中途败育的胚发育成熟分离发育不良的种子或即将败育前的种胚进行培养，促使胚继续发育至成熟，使杂交育种或远保杂交获得成功，特别对于败育胚进行早期离体培养，在遗传和育种上均具有重要意义。2.打破休眠期促进胚萌发对于有休眠期的种子，可通过胚培养。促使休眠种子提早萌发成苗，缩短育种周期或加速繁育良种。3.克服多胚品种珠心胚的干扰具有多胚发育受阻，其珠心胚可以侵入胚囊，使合子胚发育受阻影响杂交育种工作。利用胚胎培养技术，早期分离合子胚培养，排除珠心胚干扰，获得杂种胚。4.快速繁殖良种胚末5.诱导胚性愈伤组织离体胚培养的发育途径：按正常胚胎发育途径形成植株合子球形胚心形胚鱼雷形胚子叶形胚再生植株胚胎脱分化形成愈伤组织胚“早期萌发”成熟胚的培养：材料的消毒与接种，培养茎，种胚培养的外界条件原胚培养：基本培养茎：MS改良White培养茎；培养茎的渗透应用蔗糖调整，用量在8—10％生长调节：及其它附加物的影响生长调节：种类、浓度、比例附加物：天然提取物第二节胚乳培养一、胚乳培养的用途1.诱导分化植株，证明细胞全能性的理论。2.研究胚与胚乳的相生关系，胚乳组织的功能。3.再生的植株多为三倍体，有可能产生无籽果实。4.育种和性状遗传规律研究。二、胚乳培养材料的选择：细胞型期三、胚乳愈伤组织的诱导四、器官分化再生植株五、胚乳再生植株的染色体胚性第三章器官和组织培养器官培养：是植株物某一器官的全部或部分或器官原基的培养组织培养：广义：各种类型外植株的培养。狭义：各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织的培养第一节茎尖培养茎尖培养：此概念应注意茎尖的含义。一、建立无菌材料二、茎尖的发育方向及调节1.腋芽萌芽2.脱分化后产生胚状体3.脱分化后直接产生不定器官4.脱分化形成愈伤组织三、生根成苗及移栽促进生根的措施：①降低基本培养培养基无机茎浓度②调节生长素浓度③添加吸附剂④减少琼脂用量第三节固相化细胞培养固相化细胞：把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、纤维或膜上面或里面、细胞不能运动，而营养液可以在细胞间流动，供应其营养。一、固相化细胞培养的特点二、固相化细胞系统第三节单细胞培养单细胞培养：也称单细胞可隆技术，它不是指培养的只有单个细胞，而是指接种的细胞群体中，不存在悬浮培养中所可能存在的小细胞团。而是纯碎的单细胞。个单离细胞不仅仅只是在增殖阶段，它可被诱导再分化，形成完整植株。一、单离细胞的方法二、单离细胞培养技术方法三、培养细胞的密度及生活率的测定第五章原生质培养与融合第一节原生质体分离一、用以游离原生质的材料来源二、酶混合液三、游离原生质体的一般技术程序四、花粉原生质体的分离第二节原生质体培养一、培养茎二、培养方法三、原生质体的培养结果及其观察第二节原生质体融合：原生质体融合：也称体细胞杂交，就是使分离下来的不同亲本的原生质体之间在人工控制的条件下，象形细胞受精作用那样及相融合为一体。无机盐诱导融合聚乙二（PEG）与PH的Ca＋＋相结合的诱导融合方法电融合技术杂种细胞的选择和体细胞杂种的鉴定第六章细胞全能性及其营养代谢第一节植物细胞全能性一、植物细胞全能性：植物细胞具有该植物有机体的全部遗传信息，并具有形成植物有机体所有细胞类型，自然发育成完整植株的能力。二、植物细胞全能性的展观和利用外植体在腋芽萌发等情况下直接发育成苗，还克以在异养条件下脱分化，形成愈伤组织，愈伤组织可以再分化，也可以游离原生质体。用以遗传操作，或游离细胞用以次生物质生产操作的原生质体和细胞均可象愈伤组织一样，实现再分化，再分化可以是胚状体途径。也可是不定器官途径，前者可以用以制备人工种子。胚状体和不定器官均可以种质保存，也均可形成试管苗，用以快速无性繁殖。试管苗方式培育成为进行植物生命周期一样的成年植株，开花结果，完成离体培养周期。第二节培养物的营养一、碳源碳源物质以糖类物质最重要。一般的说，蔗糖是最好的糖源，其次是葡萄糖，果糖。糖的浓度一般为2—4℅二、氯源硝态氮铵态氮氨基酸有机复合物三、无机营养大量元素和微量元素四、维生素VB1VB6五、生长调节剂生长素类：1AA1BANAA2，4—D细胞分裂素类：6—BAKTZTZIP第三节培养物的次级代谢一、次级代谢概况及生物转化举例二、次级代谢的调节1.初级