高通量测序-实验基础

高通量测序-实验基础华大基因实验平台胡振飞2012年8月1核酸提取主要内容3PCR2琼脂糖凝胶电泳4DNA纯化1核酸提取1.1什么是核酸？1.2为什么要提取DNA？1.3从哪里可以提取到DNA？1.4如何提取DNA？1.1什么是核酸DeoxyribonucleotideRibonucleotide中心法则GeneticCentralDogma1.2为什么要提取DNA•获取纯度较高的DNA•遗传信息绝大部分存在于DNA中•用于后续研究，如PCR、测序，生物鉴定等1.3从哪里可以提取到DNA3、微生物细菌、酵母菌等1、人，动物组织及器官血液、肾、肝、胸腺等2、植物叶子、种子的胚芽等1.4如何提取DNA（1）DNA为白色纤维状固体（2）RNA为白色粉末状固体（3）都溶于水，在钠盐比在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。1.4.1核酸的物理性质（1）DNA和RNA在细胞中常以核酸—蛋白复合体（核蛋白）形式存在。（2）核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关（16s）1.4.2核酸的存在形式总原则：•应保证核酸一级结构的完整性；•排除其它分子的污染。鉴定：浓度、纯度、完整性鉴定技术：分光光度技术（OD）凝胶电泳技术1.4.3DNA提取基本过程细胞破碎去除杂质纯化DNADNA溶解CTAB法SDS法其它碱裂解法煮沸法其它差速离心结合SDS裂解法线粒体、叶绿体DNA的提取质粒DNA的提取非基因组DNA的提取基因组DNA的提取DNA提取方法总述CTABCTAB破碎细胞取上清酚/氯仿/异戊醇取上清氯仿/异戊醇离心离心分相离心分相离心去上清异丙醇70%酒精离心溶解得到DNA取上清材料准备CTAB提取缓冲液(Buffer)Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除提取流程材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取流程细胞裂解研磨快速、充分材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：高温温浴时，定时轻柔振荡提取流程核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿/异戊醇抽提使用变性剂变性（SDS等）高盐洗涤蛋白酶处理提取流程核酸分离、纯化多糖的去除：用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。提取流程核酸分离、纯化盐离子的去除：70％的乙醇洗涤提取流程核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解•TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase•pH值为8.0，可防止DNA发生酸解提取流程DNA电泳条带图12完整的DNA降解的DNA蛋白污染RNA污染DNA提取常见问题1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌问题二：DNA降解。对策原因1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少。对策原因1核酸提取主要内容3PCR2琼脂糖凝胶电泳4DNA纯化琼脂糖凝胶电泳2.1什么是凝胶电泳？2.3琼脂糖凝胶电泳如何操作？2.2琼脂糖凝胶电泳的原理是什么？2.1什么是凝胶电泳凝胶电泳是一项广泛应用于分析核酸和蛋白的技术琼脂糖凝胶电泳•AgaroseGelElectrophoresis聚丙酰胺凝胶电泳(PAGE)•PolyacrylamideGelElectrophoresis脉冲场凝胶电泳(PFGE)•Pulsed-fieldGelElectrophoresis2.2琼脂糖凝胶电泳原理是什么•DNA分子在碱性环境中带负电荷•当放入电场中时,DNA分子向正极运动•不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时泳动率不同，从而分出不同的条带+-PowerDNAHO2琼脂糖的电镜扫描图(1×1µm)•琼脂糖的多孔的性质使其可以承载DNA的梯度移动2.2.1DNA的迁移受什么因素影响电场强度,缓冲液,凝胶浓度…DNA的片段大小!小分子DNA的迁移速度比大分子DNA快凝胶电泳根据DNA的分子大小分离DNA+-PowerDNAsmalllarge琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系2.3琼脂糖凝胶电泳如何操作电泳电源系统分离系统检测记录系统2.3.1电泳装置组成电泳仪器电源电泳槽和制胶器紫外凝胶成像系统2.3.2凝胶的制备及电泳琼脂糖琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，从海藻中提取得到。沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度D-galactose3,6-anhydroL-galactose•AgarosewasfirstusedinbiologywhenRobertKoch*useditasaculturemediumforTuberculosisbacteriain1882配胶AgaroseBuffer梳子胶盘胶托AgaroseBufferSolutionA、称取所需量琼脂糖加1×TAE缓冲液中B、在微波炉中加热至完全熔化，中间摇匀防止爆沸D、冷却至60度C、澄清透明，无颗粒无气泡E、小心倒入制胶器中，防止产生气泡Whencooled,theagarosepolymerizes,formingaflexiblegel.Itshouldappearlighterincolorwhencompletelycooled(30-45minutes).Carefullyremovethecombsandtape.Placethegelintheelectrophoresischamber.2.3.3点样Carefullyplacethepipettetipoverawellandgentlyexpelthesample.Thesampleshouldsinkintothewell.Becarefulnottopuncturethegelwiththepipettetip.(3µlofsample+1µlofdye)2.3.4电泳电压：150V；电流：120mA；时间：30minDNA胶孔溴酚黄负极(-)正极(+)凝胶Afterthecurrentisapplied,makesuretheGelisrunninginthecorrectdirection.BromophenolbluewillruninthesamedirectionastheDNA.DNA(-)2.3.5结果分析•取下凝胶，放入EB染液中浸染。检测：10min切胶回收：30min2.3.6电泳结果TaKaRaλ-HindIII2ulTIANGEND20006ulTIANGEN50bp6ulNEB50bpDNALadder1ulM1：TIANGEND2000M2：TAKARAλ-HindIIIbp20001000750500250100bp23130941665574361232220272.3.7凝胶成像系统红色分界线EB污染区（危险）非污染区（安全，勿与污染品接触）凝胶成像系统用途：图像的拍摄和分析，包括：•DNA/RNA，蛋白质电泳图像（主要）•荧光及发光成像；•杂交膜图像；•培养皿菌落图像；将染色后的凝胶放在凝胶成像仪下观察、拍照、记录数据。1.双击桌面上的图标，进入软件：使用方法1.打开反射白灯灯开关。2.关闭反射灯开关，打开透射灯开关3.调节焦距，使图像清晰4.拍摄并保存，完毕请立即关闭灯源电源5.工作完毕，关闭软件窗口2.3.8电泳缓冲液常用的有TAE、TPE及TBE作用：•维持合适的pH•导电性•EDTA1核酸提取主要内容3PCR2琼脂糖凝胶电泳4DNA纯化3PCR3.1PCR的原理3.2PCR特异性的影响因素3.3PCR污染及措施3.1.1聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR），是在1983年由美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家Mullis所发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法，也称无细胞克隆技术(“Freebacteria”cloningtechnique)。3.1PCR原理3.1.2PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的循环。3.1.3在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以反应混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP)为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。PCR图示模板退火变性延伸模板变性新的模板退火延伸如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。3.2.1引物设计（1）典型的引物为18到24个核苷酸长，引物需要足够长，保证序列独特性。（2）选择GC含量为40％到60％的引物。（3）设计5’端和中间区为G或C的引物,这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。3.2PCR特异性的影响因素2.引物退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。3.引物浓度引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM/L，此时引物量与模板量摩尔比约为108：1。引物质量要高。冻干引物于-20℃至少可保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。4.镁离子浓度（1）镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。（2）最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μMdNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM。3.3PCR污染及预防措施PCR反应具有灵敏度极高的特点，极微量的污染即可导致假阳性的产生。PCR反应前污染：主要是样品DNA的交叉污染；PCR反应后污染：检测过程中的污染；潜在的PCR污染：仪器设备污染试剂污染来自操作者的污染预防措施：1.PCR的前处理和后处理，在不同的房间或不同的隔离工作台上进行：①标本处理区；②PCR扩增区；③产物分析区尤其是阳性对照需要在另一个隔离环境中贮存、加入。2.试剂要分装。PCR反应时，配成Mix后再分装，减少操作，减少污染。3.检查结果的重复性。污染