蔗糖对低温伤害的保护作用

蔗糖对低温伤害的保护作用李琼，何小青，邓智文（长江师范学院生命科学与技术学院2014级生物科学一班）摘要：对于植物来说，低温条件下会使细胞的膜系统遭到破坏，从而导致一些活性氧进入细胞扰乱细胞的正常生理。本实验为了测定蔗糖对低温伤害的保护作用，我们采用通过用分光度计测定过氧化物酶活性的方法来验证蔗糖对植物的低温伤害有保护作用。结果表明，一定浓度的蔗糖溶液能够减少低温对植物的伤害作用。实验过程中，我们遇到很多问题，比如蔗糖的浓度梯度设置多少合适，每天什么时间喷洒蔗糖溶液的效果最好，每天喷洒一次还是两次效果最好，什么样的低温下处理幼苗最好。通过文献的查找和老师的引导我们初步将蔗糖溶液的浓度设置为0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L。并且每天喷洒两次，早晚各一次。至于低温处理，我们是将它放置在室外，利用夜晚温度较低来达到低温处理的效果。除了这种方法可以测定之外，也可以通过测定电离度来检测蔗糖对低温伤害的保护作用。关键词：低温伤害，分光光度计，过氧化物酶ProtectiveeffectofsucroseonlowtemperatureinjuryLIQiong,HEXiaoqing,DENGZhiwen(2014classofbiologicalscience,Collegeoflifescienceandtechnology,YangtzeNormalUniversity)Abstract：Inthecaseofplants,undertheconditionoflowtemperaturecanmakethecellmembranesystemwasdamaged,resultinginanormalphysiologicalactiveoxygenintothecell.Inthisexperiment,inordertodisruptthecellprotectiveeffectofdeterminationofsucrosetochillinginjury,weusedtoverifythroughdeterminationofperoxidaseactivitybyspectrophotometeratlowtemperaturedamageonplantprotectionofsucroseeffect.Theresultsshowedthatcertainconcentrationofsucrosesolutioncanreducethedamageeffectoflowtemperatureonplants.Duringtheexperiment,weencountermanyproblems,suchassettingthenumberofsuitablesucroseconcentrationgradient,thebesteverydaywhattimetheeffectofsprayingsucrosesolution,sprayonceeverydayorthetwobest,whatkindoflowtemperaturetreatmentseedlingsthroughliteraturesearchandthebest.Wewillguidetheteacher'sinitialconcentrationofsucrosesolutionissetto0.4mol/L,0.5mol/L,0.6mol/L.andeachDayspraytwotimes,soonerorlatereachtime.Asforthelowtemperaturetreatment,wewillplaceitintheoutdoors,usethenightlowtemperaturetoachievelowtemperaturetreatmenteffect.Besidesthismethodcandetermine,canalsobedeterminedbythedegreeofionizationdetectionofsucroseonlowtemperatureinjurytoprotectthem.Keywords:lowtemperatureinjury,spectrophotometer,peroxidase过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与植物代谢及抗逆性都有密切关系[1]。过氧化物酶的作用具有双重性：它既可以在逆境或衰老初期表达，表现为保护效应，又可以在逆境或衰老后期表达，参与活化氧的生成是指物体衰老到一定程度的产物，甚至可以作为衰老的指标[2]。低温伤害被认为可能与某些毒害物质在低温下的积累有关，尤其是低温促进了活性氧的积累，并降低植物体内保护系统的功能，引起膜脂过氧化作用加剧，导致细胞膜系统结构和功能的破坏[3]。低温伤害首先是对细胞膜系统的伤害，继而发生生理学、代谢及生物化学的功能障碍，植株会表现出枯萎脱水，叶片变黄、生理失调进而影响生长发育，严重可能导致植株死亡[4]。所以，在低温条件下，除了使酶的活性受到影响之外，对于植物细胞来说，还会破坏植物细胞的膜系统，使自然界中的活性氧进入细胞，危害细胞的正常生理代谢。而植物细胞内的过氧化物酶会与这些活性氧发生反应来降低这种伤害作用，而酶的活性除了与温度和酸碱度有关之外还与酶的浓度有关。所以通过测量过氧化物酶的活性来判断植物细胞内过氧化物酶的含量，过氧化物酶的含量越多说明植物的伤害作用越大，从而达到检测蔗糖对低温伤害的保护作用。在低温胁迫下，处理植株体内可溶性糖和可溶性蛋白含量变化不明显，这几种物质均能够减轻膜脂过氧化程度[5]。总得来说，低温胁迫下导致玉米植株对氧气的利用能力降低，多余的氧气在代谢过程中被转化成活性氧，从而加剧膜的过氧化，危害植物的正常生理代谢，而植物体内的过氧化物酶是清除活性氧的一种保护酶，在过氧化氢存在下，以过氧化氢作为电子受体催化底物愈创木酚，使其氢化，生成茶褐色物质，最后用分光光度计测量生成物的含量。1材料与方法1.1实验材料实验材料是新鲜玉米叶。所用器材有分光光度计、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、研钵、容量瓶、吸管、秒表和试管。所用试剂是0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L的蔗糖溶液、愈创木酚、30％过氧化氢、100mmol/L磷酸缓冲液、（pH6.0）。反应混合液是100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）50mL和愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌至愈创木酚溶解冷却后再加入30%过氧化氢19μL混合而成。1.2操作方法将大培养皿中分隔成四个区域，加入营养土壤，注意土壤的松紧程度，再在每个区域上分别种10粒玉米，胚乳朝上。最后放置在恒温培养箱中培养。中间注意浇水。培养一星期后，将培养皿移入室外（适宜光照，夜晚温度较低的条件下）进行适当的低温处理，并分别在每个分隔区分别在叶片上浇0.4mol/L，0.5mol/L，0.6mol/L的蔗糖溶液和水，每天两次，持续一周。称取四个分隔区植物材料1g，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，以4000r/min低温离心15min，上清液即为粗酶液，定容至10mL刻度，贮于低温下备用。取5支试管，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另4支中分别加入反应混合液3mL和上述经不同浓度蔗糖溶液处理的酶液1mL。迅速将5支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470nm处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次，读数四次记录结果。结果计算：用每minOD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。过氧化物酶活性=ΔOD470×D/0.01×t式中：ΔOD470——反应时间内OD变化值。D——稀释倍数T——反应时间min。2实验结果与分析实验数据：过氧化物酶活度处理叶片的蔗糖溶液浓度（mol/L）光度值记录1234酶活度对照组0.0000.0000.0000.000000.2830.2850.2850.2890.6670.40.3110.3130.3130.3190.890.50.2390.2400.2400.2420.330.60.8210.8230.8240.8270.667通过对实验数据的分析，我们可以初步的判断，蔗糖溶液对低温伤害有一定的保护作用，并在蔗糖浓度为0.5mol/L的时候保护效果最好。但由于我们设置的浓度梯度太大，也不足以判断哪个浓度是最好的。根据每分钟所记录的光度值来看，有的在一分钟之内光度值并没有什么变化，说明此事过氧化物酶活性较低，这趟的保护作用较好，但用水处理过的玉米苗测出来的值也比较低，这可能是低温胁迫程度不够，或者蔗糖溶液在放置过程中保存不当导致变质，或者可能是为了防止产生干旱胁迫浇水时将叶片上的蔗糖溶液稀释了。从表中的数据我们可以看到0.4mol/L蔗糖溶液处理的叶片过氧化物酶的活性比水处理的还要高，说明是有很大误差的，误差的原因可能有低温对这组的玉米伤害太大，或者这组玉米还出现了其他的胁迫作用，也可能是因为在喷洒蔗糖溶液的时候不小心撒在了用水处理的那一组了。本次实验我们只是得出了一个初步的结论，其中还很在这很多问题，因为只是做了一次实验所以结果也难以准确，难以让众人信服。3分析讨论4参考文献[1]缴丽莉,倪志云,路丙社,等.低温胁迫对青榨槭幼树抗寒指标的影响[J].河北农业大学学报，2006（04）.[2]赵丽英,邓西平,山仑，等.活性氧清除系统对干旱胁迫的响应机制[J].西北植物学报，2005（02）.[3]朱世东.茄果类幼苗低温伤害与膜脂过氧化作用[J].安徽农学院学报，1991，18（2）：141-146.[4]潘杰,简令成.植物寒害和抗寒机制中膜与蛋白质研究的进展[J].植物学通报，1990（01）.[5]苗永美，王万洋，杨海林，等.外源钙离子，SA，和ABA缓解甜瓜低温胁迫伤害的生理作用[J].南京农业大学学报，2013,36(4):25-29.