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第四章发酵工程发酵工程:是利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。又称微生物工程。发酵（fermentation）微生物在无氧时的代谢过程生物化学利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程现在定义“发泡”（fervere）发酵工程的内容包括三部分:1.上游工程：优良种株的选育，最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定，营养物的准备等。2.中游工程：在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。3.下游工程：从发酵液中分离和纯化产品的技术发酵的发展简史•传统型—天然发酵•第一代—纯培养技术的建立•第二代—深层培养技术•第三代—微生物工程1天然发酵•原始社会就会利用含糖果实进行酒精发酵。•公元前4000-3000年,古埃及人熟悉了酒、醋的酿造方法。•我国在4200-4000年前的龙山文化时期已有酒器出现。•主要产品有：酒、酱油、泡菜、奶酒、干酪等。•特点：不能控制发酵过程，生产只能凭经验。第一代—纯培养技术的建立•1680年,荷兰的列文虎克(AnthonyLeeuwenhoek)制成了显微镜,并通过显微镜观察到了微生物.•19世纪中期，法国的巴斯德（LouisPasteur)证明了酒精发酵是由活酵母引起的，各种不同的发酵产物是由不同的微生物产生的。•德国的柯赫（RobertKoch)发明了固体培养基，得到了细菌的纯培养物，由此建立了微生物的纯培养技术。•产品主要有：酵母、酒精、丁醇、有机酸、酶制剂等。•特点：靠厌氧发酵和表面固体发酵。第二代—深层培养技术•1928年，英国的细菌学家弗莱明(Fleming)发现了能够抑制葡萄球菌的点青霉，其产物称为青霉素。•第二次世界大战中对于抗感染药物的极大需求，促使人们重新研究青霉素。至1945年，采用了深层培养技术，将青霉素进行大规模生产。•主要产品：各种抗生素、氨基酸、酶制剂、维生素等。•特点：发酵产量大大提高，可选择性地发酵所需产物第三代—微生物工程•1953年，美国的Watson和Crick发现了DNA双螺旋结构。•70年代，DNA体外重组技术的建立。•主要产品：胰岛素、生长激素、细胞因子、单克隆抗体等•特点：采用基因工程技术对微生物进行改造，使微生物生产出他们本身不能生产出的产品。1微生物菌体发酵发酵目的：获得多种用途的微生物菌体发酵工艺酵母发酵微生物菌体蛋白发酵药用真菌发酵微生物杀虫剂的发酵传统菌体发酵一发酵类型：5种2微生物酶发酵：淀粉酶，氨基酰化酶3微生物代谢产物发酵微生物产物类型：微生物发育周期适应期对数期：静止期：死亡期产生菌广泛产生菌稀少初级代谢产物次级代谢产物（中间体或产物）（前体或起始物）3微生物代谢产物发酵次级代谢产物：微生物细胞形成的对细胞的生长繁殖没有明显影响的一类化合物，一般是在稳定期形成，如抗生素等，称为次级代谢产物。初级代谢产物：微生物合成的为细胞生长繁殖所必需的物质。如氨基酸、核苷酸等，称为初级代谢产物。4微生物的转化发酵………甾类转化抗生素转化乙醇异丙醇甘油乙酸丙醇二羟基丙酮5生物工程细胞的发酵进行培养的新型发酵杂交瘤细胞“工程菌”“杂交”细胞动、植物细胞固定化的活细胞等基因工程菌t-PA、凝乳酶、胰岛素、干扰素单克隆抗体发酵技术的特点发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成；发酵过程在常温常压下进行的，条件温和，能耗少，设备简单；原料通常以糖蜜，淀粉为主；容易产生高分子复杂的化合物，能高度选择性地在复杂花和无的特定部位进行氧化，还原；发酵过程中需要防止杂菌污染。发酵技术的应用1.医药工业：抗生素，维生素，疫苗等2.食品工业：微生物蛋白，氨基酸，饮料等3.能源工业：气体燃料，酒精等4.化学工业：生物塑料，化工原料等5.冶金工业：矿场的开采，金属的浸提等6.农业：生物固氮，生物杀虫剂，微生物饲料7.环境保护：第二节微生物发酵过程酵母菌缺氧：酒精有氧：菌体微生物发酵过程是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。发酵类型微生物黑曲霉：柠檬酸棒状杆菌：谷氨酸乳酸杆菌：乳酸好氧厌氧兼性厌氧好氧发酵厌氧发酵兼性发酵第二节微生物发酵过程培养基状态固体液体发酵设备敞口发酵：繁殖快并且进行好氧发酵类型的。密闭发酵：密闭的设备进行。浅盘发酵：仅装有一薄层营养液的浅层。深层发酵：固体发酵液体发酵一发酵工业中的常用微生物发酵工业常用细菌枯草芽孢杆菌：淀粉酶乳酸杆菌：乳酸醋酸杆菌：醋酸棒状杆菌：氨基酸短杆菌：肌苷酸细菌、放线菌、酵母菌、霉菌1细菌2放线菌原核生物，菌落呈放射状,多存在于微碱性环境中,以无性孢子和菌丝片段（液体沉没培养）进行繁殖。放线菌的最重要的应用是用来生产多种抗生素：链霉素、金霉素、红霉素、庆大霉素.3酵母菌单细胞真核生物，主要分布在含糖较多的偏酸性环境中，以单细胞存在，以发芽形式进行繁殖。常用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。4霉菌霉菌喜偏酸性环境，以无性孢子和有性孢子繁殖。发酵工业常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等。5其他微生物：担子菌、藻类担子菌（菇类）：多糖及抗癌药物藻类：保健食品和饲料，如螺旋藻培养基孢子培养基：制备孢子种子培养基：孢子发芽和菌体生长繁殖发酵培养基：菌体生长繁殖和合成代谢产物1.培养基按用途（从发酵生产应用考虑）分为3种类型：二培养基2发酵培养基的组成培养基成分碳源：单糖、双糖、多糖氮源：有机氮和无机氮无机盐和微量元素生长因子、前体和产物促进剂水（1）、碳源1）作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分2）来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃2、氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1）无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水2）有机氮源:花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉等。3、无机盐和微量元素4、生长因子、前体和产物促进剂从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。1）生长因子前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。2）前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。3）产物促进剂5、水三发酵的一般过程培养基原料菌种摇瓶种子罐生产罐培养液菌体分离上清液产品抽提、精制配制灭菌灭菌灭菌接种扩大发酵接种培养基斜面菌种活化→一级种子培养（摇瓶）→二级种子培养（种子罐）→发酵2.种子扩大培养1菌种实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行。3.发酵XS（底物）─→X（菌体）＋P（产物）发酵研究的内容：菌种的来源——找到一个好的菌种发酵过程的工艺控制——最大限度发挥菌种的潜力4.下游处理发酵液预处理和固液分离提取精制成品加工第三节液体深层发酵一发酵的操作方式分批发酵、连续发酵、补料分批发酵1分批发酵营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排除，与外部没有物料交换。第三节液体深层发酵分批发酵工艺流程图第三节液体深层发酵微生物分批培养的生长曲线1.延滞期；2.加速生长期；3.指数生长期；4.减速期；5.稳定期；6.衰亡期优点:操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点:产率低，不适于测定动力学数据2连续发酵反应器搅拌罐式反应器管式反应器是指以一定的速度向发酵灌内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵灌内的液量维持恒定。一发酵的操作方式第三节液体深层发酵单罐连续发酵多罐串联连续发酵管式连续发酵连续发酵的优点是：①稳态操作，使产品的产率和质量保持稳定；②更有效地实现机械化和自动化；③减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用的时间；④测量仪器由于减少灭菌次数而延长寿命；⑤容易对过程进行优化，提高发酵产率。连续发酵的缺点：①由于是开放系统，发酵周期长，容易造成杂菌污染；②微生物易发生变异；③对设备、仪器的技术要求较高；④黏性丝状菌菌体容易附着在器壁上及在发酵液中结团。连续发酵主要应用于研究，很少用于工业生产。3补料分批发酵补料分批发酵在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。单一补料分批发酵反复补料分批发酵。发酵过程工艺控制的目的:创造一个适合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来；从而使目标产品得到最大的比生产速率和最大的生产率。二发酵工艺控制糖代谢产生的中间物合成菌体的前体合成产物的前体合成副产物环境环境环境直接参数:温度、pH、溶解氧浓度、压力、发酵液粘度等；间接参数:细胞生长速率、产物合成速率和呼吸熵等。发酵过程变化的参数从检测手段分可分为：直接参数、间接参数(1)温度对生长的影响根据微生物对温度的要求大致可分为四类：1温度在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。(2)温度对发酵过程的影响：①温度影响反应速率；②影响菌体代谢产物的合成方向；③影响发酵液的理化性质等。调节：向发酵灌的夹套或蛇形管中通入冷水、热水或蒸汽2pHpH对发酵过程的影响：①影响酶的活性；②影响细胞膜的通透性；③影响培养基组份及中间代谢产物的解离；④影响菌体代谢过程的变化pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。细菌的最适pH为6.3-7.5；酵母菌和霉菌的最适pH为3-6；放线菌的最适pH为7-8。微生物生长和产物合成阶段的最适pH往往不同例青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0,产物合成最适pH7.2~7.4四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0pH的调控（1）调节好基础料的pH，基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。（2）在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等（3）通过补料调节pH在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH（4）当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH3溶解氧浓度供氧：调节搅拌转速和通气速率大型发酵罐搅拌装置发酵车间的空气过滤器需氧：调节菌体浓度、基质浓度及其它工艺措施放罐时间要根据发酵罐的生产力和产品成本来确定。下表是一发酵罐内葡萄糖含量随时间的变化数据，仔细分析数据，回答问题：这是什么发酵操作方式？该操作方式有什么优点？时间/（d）0135791114葡萄糖含量/（g/L）2018103151041这是补料分批发酵方式。该方法具有如下优点：①可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物阻遏作用。②可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率；③菌种的变异及杂菌污染问题易控制；④便于自动化控制。四下游加工过程从发酵液中分离和精制有关产品的过程称为下游加工工程。下游加工包括：发酵液的预处理，固液分离，提取，精制以及成品加工。四下游加工过程1发酵液预处理和固液分离预处理:酸化、加热、加絮凝剂等固液分离：过滤、离心等方法2提取（1）吸附法（2）离子交换法（3）沉淀法（4）萃取法（5）超滤法3精制大分子物质：层析技术小分子物质：结晶4成品加工浓缩、无菌过滤和去热源、干燥、加稳定剂第五节典型产品的发酵生产一抗生素发酵生产抗生素是生物体在生命活动中产生的一种次级代谢产物。青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素，它