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第四章植物细胞工程的基本原理和技术基础§1.植物细胞工程的基本原理§2.植物细胞和组织培养所需要的营养和环境条件§3.外植体的选择和消毒§4.外植体的切取和培养§4.1植物细胞工程的基本原理一.植物细胞的全能性二.植物激素的调控作用4.1.1植物细胞的全能性植物细胞工程常用的技术是植物组织培养植物体细胞杂交植物细胞工程的理论基础是：植物细胞的全能性概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。细胞的全能性受精卵的全能性最高；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；体细胞的全能性比生殖细胞低得多。在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。植物组织培养的概念植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛生芽，最终形成完整的植株。植物体植物组织培养的条件：植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化根或芽等器官适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件胡萝卜愈伤组织诱导结果胡萝卜愈伤组织诱导结果细胞全能性的绝对性与相对性:(1)不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;(2)即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;(3)动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心形成层薄壁细胞厚壁细胞(木质化细胞)特化细胞(筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织居间分生组织侧生分生组织薄壁组织(基本组织)厚角组织输导组织厚壁组织。脱分化：一个已经停止分裂繁荣成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的细胞团或愈伤组织的现象。再分化：原以分化的细胞经过脱分化后再次分化的现象，最终可进一步形成完整的小植株。离体培养中细胞的脱分化（Dedifferentiation）脱分化外植体―→愈伤组织或↗体细胞胚↘完整植株脱分化细胞↘不定器官↗直接伸长茎尖培养（较大时）――→完整植株发育幼胚培养（较大时）――→完整植株愈伤组织：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。愈伤组织的种类：1、胚性愈伤组织（Embryoneniccallus）：表面光滑、组织结构紧凑、黄绿色、细胞小、易碎、再生力强。胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。易形成芽。2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大，淡黄色或白色。可以用于悬浮细胞系的建立。4.1.2植物激素的调控作用生长素：启动细胞的分裂，在细胞的脱分化、形成愈伤组织的过程中必不可少。如IAA、NAA、IBA、2,4-D。细胞分裂素：促进细胞分裂和芽的形成，如KT、6-BA、Zt。4.2植物细胞和组织培养所需的营养和环境条件一、培养基的组成和配制二、影响植物组织培养的环境条件4.2.1培养基的组成和配制●培养基的基本成分●培养基的种类和配制●培养基的基本成分⑴无机成分：大量元素和微量元素⑵碳源：如蔗糖⑶维生素：如肌醇⑷植物生长物质：生长素和细胞分裂素⑸有机附加物一、培养基的成分及其作用（一）无机营养物质培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量元素。大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。培养基中加入量最多的是N，N一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供。微量元素微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co、Cl化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。（二）有机化合物有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物质和一些其它的有机添加物。1、维生素类物质维生素类物质在酶系统中有催化功能。硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc），Vc等。2、AA类物质绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用的有Gly（甘氨酸）、Asn（天冬酰胺）、Gln（谷氨酰胺）。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。3、糖类糖在培养基的作用：1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量3）、维持渗透压蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。4、其它有机物质1）肌醇（环己六醇）肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成，利于胚和芽的形成。2）天然有机物一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。（三）植物生长调节物质植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，而植物生长调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。1、生长素类：1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）2）萘酸类：NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。生长素的生理作用1、促进细胞生长和细胞分裂；2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；3、形成愈伤组织，促进生根；4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。ABCA：NAA0mg/L，芽（少），根（无）B：NAA0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量）2、细胞分裂素是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（6-糖基氨基嘌呤，KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-苄基氨基嘌呤。功能：1、促进细胞的分裂和分化；2、诱导芽的分化；3、促进侧芽的萌发和生长；4、抑制衰老。ABA：BA(0mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）控制植物细胞分化分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件比例高时——产生芽,比例低时——产生根3、赤霉素（GA3）生理作用：1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效；2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化；3、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发；4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用。注：不耐热，应采用过滤灭菌加入4、脱落酸（ABA）生理作用：1、抑制蛋白质的合成；2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用；3、诱导休眠、促进衰老和脱落。以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用ppm表示1ppm=1mg/L●培养基的种类和配制⑴培养基的种类：见表4-1（MS、B5、N6）。⑵培养基的配制培养基的配方及培养基的选择一、培养基的种类（根据无机盐的浓度）：1、高无机盐含量培养基钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS、LS、BL、BM、ER培养基。2、高硝态氮培养基硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养基。3、中等无机盐含量培养基大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有Nitch，NT、H、Miller培养基。4、低无机盐含量培养基大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。二、根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养物的培养基。三、根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。四、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%培养基的筛选：1.无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养，豆科多用B5培养基。2、植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。3、有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。培养基的配制（一）、贮备液（母液）的配制为什么要配制母液？1）、方便2）、准确（有些成分量太小）以MS培养基配制为例：1、大量元素母液的配制各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。注意：(1)某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。(2)CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。２、微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe）组成。微量元素用量较少，特别是CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基，取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ１ml3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配