第5-6章血液分析技术和相关仪器.

第五、六章血液分析技术与相关仪器血液分析技术与相关仪器血液分析仪器是临床实验室最常用的分析仪器，包括：血细胞分析仪血液凝固分析仪血液流变学分析仪第一节血细胞分析仪一、血细胞分析仪概述血细胞分析仪(Bloodcellanalyzer,BCA)是指对一定体积全血内血细胞异质性进行自动分析的临床检验常规仪器。又称血细胞自动计数仪(ABCC)、血液学自动分析仪(AHA)。ABCC代表早期的低档次BCA，AHA外延过大。发展史手工计数仪器简单计数两分群三分群五分群五分群＋网织红20世纪40年代末，电阻抗法微粒子计数专利50年代，CoulterModelA型用于临床60年代，测定参数达7项70年代，全血细胞计数（CBC）80年代，双通道、白细胞2~3分群、五分群90年代以来，多功能、多参数、流水线二、仪器分型检测原理基本结构（一）血细胞分析仪分型按自动化程度按检测原理按对白细胞的分类水平嗜酸性细胞淋巴细胞单核细胞中性粒细胞血小板嗜碱性细胞血细胞与等渗的电解质溶液相比为相对的不良导体电阻值大于稀释液的电阻值当细胞通过检测器微孔的孔径感受区时，在内外电极之间恒流源电路上，电阻值瞬间增大，产生一个电压脉冲信号产生的脉冲信号数，等于通过的细胞数，脉冲信号幅度大小与细胞体积大小成正比(二)电阻抗法血细胞检测原理电阻抗法血细胞检测原理1.白细胞的检测仪器将体积为35～450fL的血细胞，分为256个通道(channel)。每个通道：1.64fl根据细胞大小，分别置于不同的通道中，显示血细胞体积分布直方图（Histogram）。经溶血素处理脱水后，血细胞体积大小发生了变化！！！第一群（35～90fl）小细胞区：淋巴细胞（体积最小）：一般在35～90fl。第二群（90～160fl）是单个核细胞区，（中间细胞）：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始、幼稚细胞、异常细胞等第三群（160fl以上）大细胞区：嗜中性粒细胞（体积最大）：一般在135-350fl%3590160300400450(fl)2.红细胞和血小板的检测红细胞和血小板共用一个小孔管，正常人红细胞体积和血小板体积间有一个明显界限，血小板计数准确容易。CPU对血小板和红细胞分布图进行判断浮动界标血小板分析与干扰因素（三）联合检测型原理主要体现在白细胞分类，实质是选用较特异的方法将血中含量较少的嗜酸、嗜碱性粒细胞检出，发现异常细胞。共有特点是：均使用了鞘流技术。前鞘流后鞘流检测窗1.容量、电导、光散射检测技术光散射电导性电阻抗每个细胞接受三维分析，定义到三维散点图的相应位置体积(volume，V)电阻抗原理测定细胞体积和数量电导性(conductivity，C)高频电磁探针，测量细胞内部结构，细胞内核浆比例光散射(scatter，S)细胞内粗颗粒的光散射强度要比细颗粒更强。2.光散射与细胞化学联合检测技术这类仪器是应用激光散射与细胞化学染色技术对白细胞进行分类计数。高角度前向散射光：细胞核及颗粒的信息低角度前向散射光：细胞大小的信息结合细胞化学染色技术对白细胞进行分类计数3.多角度激光散射联合检测技术（MULTI-ANGLEPOLARIZEDSCATTERSEPARATIONOFWHITECELL,MAPSS）基本原理：基于细胞大小、折射率、核形、核浆比值、以及颗粒性质等，均可影响不同角度下的散射光强度。不同白细胞在以上几个方面完全一致的几率很小，从而对白细胞进行分类。①0°：前角光散射（1°～3°），可粗略测定细胞大小。②10°：狭角光散射（7°～11°），可测定细胞内部结构相对特征。③90°：垂直光散射（70°～110°），测定细胞核分叶情况。④90°：消偏振光散射（70°～110°），区分嗜酸性粒细胞与其他细胞。4.电阻抗、射频与细胞化学联合这类仪器是利用电阻抗、射频这一成熟细胞计数技术结合细胞化学技术，通过4个不同的检测系统对白细胞、幼稚细胞进行分类和计数。嗜酸性粒细胞检测系统嗜碱性粒细胞检测系统淋巴、单核和粒细胞检测系统幼稚细胞检测系统白细胞分类散射图联合使用多项技术(流式、激光、射频、电导、电阻抗、细胞化学染色)同时分析一个细胞，综合分析实验数据，从而得出较为准确的白细胞“五分群”结果。（四）网织红细胞检测原理网织红细胞中嗜碱性物质RNA，在活体状态下与特殊的荧光染料结合。荧光强度与RNA含量成正比。用流式细胞术检测网织红细胞大小和RNA含量及血红蛋白的含量。细胞与试剂反应前后的变化反应前反应后荧光(RNA)强度ReticulocytesPLTRBC高荧光强度低荧光强度低荧光强度WBC前向散射光(细胞大小)血细胞分析仪网织红细胞成熟度分类（五）血红蛋白测定原理除干式、无创型外，各型BCA对血红蛋白测定都采用光电比色原理血细胞悬液中加入溶血剂后，红细胞溶解释放出血红蛋白，后者与溶血剂中有关成分结合形成血红蛋白衍生物，进入血红蛋白测试系统特定波长(530～550nm)下进行光电比色（六）仪器基本结构机械系统电学系统血细胞检测系统血红蛋白测定系统计算机键盘控制系统1.机械系统包括机械装置（如全自动有进样针、分血器、稀释器、混匀器、定量装置等）和真空泵，以完成样本的定量吸取、稀释、传送、混匀，以及将样本移入各种参数的检测区2.电学系统包括主电源、电压元器件、控温装置、自动真空泵电子控制系统，以及仪器的自动监控、故障报警和排除等3.血细胞检测系统国内常用的血细胞分析仪，使用的检测技术可分为电阻抗检测技术和光散射检测技术两大类电阻抗检测技术：由检测器、放大器、甄别器、阈值调节器、检测计数系统和自动补偿装置组成流式光散射检测技术：由激光光源、检测装置和检测器、放大器、甄别器、阈值调节器、检测计数系统和自动补偿装置组成4.血红蛋白测定系统由光源、透镜、滤光片、流动比色池和光电传感器等组成。5.计算机和键盘控制系统三、仪器的性能指标、评价与调校（一）血细胞分析仪的性能指标1.测试参数2.细胞形态学分析3.测试速度4.样本量5.精密度与示值范围6.打印（二）血细胞分析仪的评价ICSH公布了电子血细胞分析仪的评价方案：在细胞计数、血红蛋白测定方面，要评价仪器测试样本的总变异、携带污染率、线性范围、可比性和准确性等（三）血细胞分析仪的调校出厂前已经过厂方技术鉴定合格，但由于运输振动或因故障维修后或长时间停用后再启用等原因，以及正常使用半年以上或认为有必要时，都必须对仪器进行调校及性能测试，这对了解仪器性能，发现问题，确保检验质量有重要意义四、仪器的维护与常见故障（一）仪器的维护1.安装：洁净的环境、稳定的电源、可靠的接地、适宜的温度和湿度是保证BCA正常工作的前提。2.维护：良好的工作环境是仪器正常工作的前提，精心细致的维护是仪器处于良好工作状态的保证。做好仪器的维护保养，有助于提高仪器测量的准确性，减少故障的发生，延长仪器的使用寿命。检测器的维护①采血顺利②防止纤维丝堵孔③关机前对检测器的微孔进行清理冲洗④计数期间，及时按“反冲”键，冲掉沉积变性的蛋白质⑤定期卸下检测器，用5%次氯酸钠浸泡清洗管路的维护机械传动部位的维护四、仪器的维护与常见故障（二）常见故障有自我诊断功能，有故障发生时，内置电脑的错误检查功能显示出“错误信息”，并伴有报警声四、仪器的维护与常见故障1.开机时的常见故障2.测试过程中常见的错误信息其中检测器的微孔堵塞是影响检验结果准确性最常见的原因。根据微孔堵塞的程度，将其分为完全堵孔和不完全堵孔两种。红细胞和血小板计数原理的改进二维激光散射法测定红细胞和血小板克服了电阻抗法在病理情况下测定MCH、MCHC结果不准及血小板计数精确性较差的缺点五、血细胞分析仪的进展第二节血液凝固分析仪血液凝固分析仪（automatedcoayulationanalyzer,ACA）是采用一定分析技术，对血栓与出血有关成分自动检测的临床常规检验仪器在血栓/出血实验室中最基本的设备就是血液凝固分析仪（简称血凝仪）发展史1910年，Kottman发明了最早的血凝仪1950年，Schnitger和Gross发明了基于电流法的血凝仪20世纪70年代前为血凝仪的初级阶段20世纪70年代，较精确的各种自动血凝仪先后问世，其特点是：单通道、终点法的半自动血凝仪，也称第一代产品20世纪80年代末，多通道、多种分析方法与原理的半自动血凝仪相继诞生，称之为第二代产品20世纪90年代以来，多通道、多方法、多功能全自动（即第三代）血凝仪不断涌现一、血凝仪分型与检测原理（一）血凝仪分型按自动化程度半自动血凝仪全自动血凝仪全自动血凝工作站（二）血凝仪检测原理主要检测方法：凝固法、底物显色法、免疫学法、干化学法等。检测原理（二）底物显色法生物化学法：以底物释放产色基团量的变化测定有关因子（一）凝固法生物物理法电流法——纤维蛋白原——纤维蛋白——导电光学法散射比浊法——凝固过程中散射光变化透射比浊法——凝固过程中吸光度变化浊度变化光度变化双磁路磁珠法——钢珠振幅衰减程度判断终点光电磁珠法——吸光度衰减程度判断终点超声波法——超声波衰减程度判断终点（三）免疫学法抗原抗体免疫扩散法火箭电泳双向免疫电泳免疫比浊ELISA法直接比浊乳胶比浊散射比浊透射比浊1．凝固法原理是通过检测血浆在凝血激活剂作用下发生一系列物理量（光、电、超声、机械运动等）的变化，再由计算机分析所得最终结果，称生物物理法。按测量原理分为电流法、超声分析法、光学法和磁珠法四种。光学法（比浊法）：是根据血浆凝固过程中浊度的变化，导致光强度变化来测定相关因子12111光学法血凝仪工作流程纤维蛋白的形成与吸光度双磁路磁珠法原理：测试杯的两侧各有一组驱动线圈，产生恒定的交替电磁场，使杯内去磁小钢珠保持等幅振荡运动；凝血激活剂加入后，随着纤维蛋白的增多，血浆黏稠度增加，小钢珠运动振幅逐渐减弱，将运动幅度衰减到50时确定为凝固终点双磁路磁珠法原理双磁路磁珠法与光学法原理主要区别前者是检测血浆凝固过程中磁电信号变化后者是检测该过程中光信号的变化2.底物显色法原理：实质为光电比色原理，是通过测定产色底物的吸光度变化来推测所测物质的含量和活性，也称生物化学法3.免疫学法原理以纯化的被检物质为抗原，制备相应的抗体，然后利用抗原抗体反应对被检物进行定性或定量测定。血凝仪使用免疫比浊法二、血凝仪的基本结构与评价（一）血凝仪基本结构：1.半自动血凝仪基本结构主要由样本预温槽和试剂预温槽、加样器、检测系统（光学、磁场）及微机组成2.全自动血凝仪基本结构包括样本传送及处理装置、试剂冷藏位、样本及试剂分配系统、检测系统、计算机、输出设备及附件等（二）血凝仪评价1.一般性评价：①产品质量50%；②价格25%；③厂商评估10%；④担保5%；⑤售后服务5%；⑥可接受性5%。2.技术性能评价：重复性测定、线性范围、准确性、携带污染率、干扰因素、可比性分析等几方面（三）血凝仪的特点1.半自动血凝仪：①手工加样加试剂；②操作简便；③应用检测方法少；④价格便宜；⑤速度慢；⑥测量精度好于手工，但低于全自动2.全自动血凝仪：①自动化程度高；②检测方法多；③通道多，速度快；④项目任意组合，随机性；⑤测量精度好，易于质控和标准化；⑥智能化程度高，功能多；⑦价格昂贵；⑧对操作人员的素质要求高。三、血凝仪的维护（一）半自动血凝仪的维护①保持测试槽清洁，严禁有异物进入；②避免阳光直晒和远离强热物体；③防止受潮和腐蚀；④仪器和加珠器都必须远离强电磁场干扰源；⑤电源电压为220V±10％，最好使用稳压器；⑥使用一次性测试杯及钢珠（二）全自动血凝仪的维护①清洗或更换空气过滤器；②检查及清洁反应槽；③清洗洗针池及通针；④检查冷却剂液面水平；⑤清洁机械运动导杆和转动部分并加润滑油；⑥及时保养定量装置；⑦更换样品及试剂针；⑧数据备份及恢复等四、血凝仪的临床应用与进展（一）临床应用1.凝血系统的检测2.抗凝系统的检测3.纤维蛋白溶解系统检测4.临床用药的监测（二）进展主要体现在：①多方法、多功能