第5章分子发光分析法.

第五章分子发光分析法MolecularLuminescence第一节荧光分析法第二节磷光分析法第三节化学发光分析分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁到激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光。光致发光按激发态的类型不同又分为荧光和磷光两种。本章主要讨论分子荧光(MolecularFluorescence)、分子磷光(MolecularPhosphorescence)化学发光分析法(Chemiluminescence)第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。荧光分析法的最大优点是灵敏度高，选择性也比较好，检测限通常比分光光度法低2-4个数量级。虽然应用不如分光光度法广泛，但在微量、痕量分析及生命科学研究等中具有重要意义。二、基本原理（一）分子荧光的产生在单重激发态中，两个电子自旋配对，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。分子能级=电子能级(Ee)+振动能级(Ev)+转动能级(Er)。二、基本原理（一）分子荧光的产生S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转化振动弛豫能量l2l1l3外转换l3T2内转化振动弛豫分子荧光、分子磷光是如何产生的？振动弛豫：指在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。内转化:相同多重态的两个电子态之间的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。体系间窜跃：指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。外转移:指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。S0S1S2T1吸光l1吸光l2荧光l3荧光能级图荧光发射处于第一激发单重态最低振动能级中的电子跃回至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意:激发态中存在振动驰豫和内转化跃迁。很明显，荧光的光子能量比其分子受激发所吸收的光子能量低，因此荧光波长λ3激发波长λ2或λ1，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-6-10-9s内完成。磷光发射处于第一激发单重态最低振动能层的电子，经体系间窜跃跃迁到第一激发三重态，并经振动弛豫至最低振动能层，然后跃迁回到基态各振动能级,发射波长为l´3的磷光。磷光波长l´3＞荧光波长λ3＞激发波长λ1或λ2。磷光的产生在10-3-10s内完成。S0吸光l1吸光l2S2S1T1磷光l´3荧光l3磷光荧光在光照停止后，仍可持续一段时间。•磷光与荧光的区别:两长一低：波长、寿命、强度电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光磷光内转化外转化系间窜跃振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。（二）荧光效率及其影响因素分子产生荧光必须具备两个条件:①分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率（即荧光效率）。1、荧光效率荧光效率也叫荧光量子产率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示f=发射荧光的分子数/激发态分子的总数吸收的光量子数发射的光量子数荧光的量子产率，将与上述每一个过程（荧光发射、内转化，系间窜跃等）的速率常数有关。若用数学式来表达这些关系，得到f=kf/（kf+ki）式中kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率常数的总和。凡是能使kf值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光。一般来说，kf主要取决于化学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。f在0.1—1之间有应用价值2、荧光与分子结构的关系跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历或n激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生或n跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光（较大的量子产率,跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。共轭效应:增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。1)分子中必须具有大的共轭键结构。如:芳香族化合物有荧光。单个杂环芳烃无荧光，而其与苯环共轭就有荧光。NNSNHNNNH非荧光性:荧光性:吡啶呋喃噻吩吡咯喹啉吲哚2)具有刚性平面性结构的分子荧光量子产率高。可降低分子振动和碰撞去活的可能性，故具有很强的荧光。络合剂与金属络合后，刚性增强，荧光也增强:3)取代基的影响芳环上有供（给）电基，使荧光增强。如烷基、-OH、-OCH3、-NH2、-CN等使荧光强度增加。吸电子取代基使荧光强度降低。如-COOH、RCO-、-NO2取代，猝灭荧光。卤素原子取代重原子效应的影响，荧光减弱，磷光增强。卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓“重原子效应”使S1→T1系间跨越速率增加所致。3、环境因素对荧光的影响①溶剂对荧光强度的影响。由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱可能会有显著不同。一般情况，增大溶剂的极性，将使n跃迁的能量增大，跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。温度上升使荧光强度下降。②温度对荧光强度的影响④表面活性剂和溶液中溶解氧的影响。溶液中含有表面活性剂，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。溶液中有溶解的氧，使激发单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，荧光效率降低。③溶液pH值对荧光强度的影响带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH值有关。（三）荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度If正比于吸收的辐射强度Ia与荧光效率f。If=fIa式中f为荧光量子效率，又根据Beer定律Ia=I0-It=I0(1-10-A)I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得If=fI0(1-10-A)=fI0(1-e–2.3A)在浓度很低(A小于0.05)时整理得:If=2.3fI0A=2.3fI0bcxxxxex1...!3!2132泰勒级数展开当入射光强度I0和其他条件一定时，上式为:If=Kc即荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当lc0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。图5－2荧光强度与溶液浓度的关系标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；荧光猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。导致荧光猝灭的主要类型:1.产生“自吸收”一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。2.碰撞猝灭处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。与溶液浓度有关，浓度较大易发生荧光猝灭（四）荧光的激发光谱和发射光谱1.激发光谱:荧光为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线。如果固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线。即荧光发射光谱或磷光光谱。2.发射光谱三、荧光分析仪器用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器和显示系统五部分组成。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。（2）样品池荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。（3）单色器两个单色器(光栅)（4）检测器由光电管和光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。（1）激发光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度，因此，荧光分光光度计通常的光源是氙灯、高压汞灯、染料激光器(可见与紫外区)与分光光度计的主要差别①垂直测量方式,消除透射光影响②两个单色器，激发和发射，常用光栅光源：高发射强度。常用氙灯。高灵敏度原因：测量I非A，提高激发光强度，现代技术测弱光信号㈠、无机物的分析无机离子本身能发荧光的很少，但很多能与一些有机化合物形成荧光物质进行分析；目前能进行荧光分析的元素已近70种，较常采用荧光法测定的元素有铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉等。⑴、能同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。⑵、荧光分析中常用的另一类络合物是三元离子缔合物。⑶、荧光猝灭法也是常用的方法。四、荧光分析法的应用㈡、有机化合物的分析⑴、脂肪族有机化合物的分子结构较为简单,本身能发生荧光的很少,一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析,如丙三醇与苯胺在浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，据此可以测定0.1~2µg•mL⁻¹的丙三醇.⑵、芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系,多数能发生荧光,可直接用荧光法测定。⑶、在生化分析等领域，如维生素等可以用荧光法分析第二节磷光分析法一、概述磷光是分子从亚稳态的三重态跃迁至基态时产生的辐射。磷光在药物分析、有机分析等方面有重要的应用。二、基本原理（一）磷光的强度IP=2.3PI0bc=Kc在室温条件下，溶剂分子的剧烈运动会与激发三重态的分子碰撞而导致失活，磷光很难产生，通常应在低温下测量磷光。低温磷光分析中，液氮是最常用的合适的冷却剂。在低温（77K）下，形成透明的刚性玻璃体，某些物质有强烈的磷光。(二）温度对磷光强度的影响（三）重原子效应使用含有重原子溶剂或在磷光物质中引入重原子取代基(当分子中引入重原子取代基，例如，当芳烃分子中引入杂原子或重原子取代基时)，都可以提高磷光物质的磷光强度，这种效应称为重原子效应。前者称为外部重原子效应。后者称为内部重原子效应。重原子效应的机理是，重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错，容易引进或增强磷光分子的自旋轨道偶合，从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。（四）室温磷光由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制等因素，从而发展了多种室温磷光法（RTP）。（1）固体基质室温磷光法（SS-RTP）此法基于测量室温下吸附于固体基质上的有机化合物所发射的磷光。（2）胶束增稳的溶液室温磷光法（MS-RTP）三、磷光分析仪磷光分析仪与荧光分析仪结构相似，也是由光源、激发单色器，液槽、发射单色器、检测器和放大显示装置所组成。在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即可用于磷光测定。1、将样品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温磷光测定。2、磷光镜的机械切光装置。四、应用