第5章生产菌种的制备与保藏

2019/12/18发酵工艺学TechnologyofFermentation理论授课内容及学时分配第1章绪论（2学时）第2章发酵设备（2学时）第3章菌种选育理论与技术（4学时）第4章培养基、灭菌与除菌（3学时）第5章生产菌种的制备与保藏（2学时）第6章发酵过程的供氧（2学时）第7章发酵过程的控制（4学时）第8章次生代谢产物的生物合成（2学时）第9章抗生素发酵工艺（3学时）第10章氨基酸与核苷酸发酵（3学时）第11章维生素与核苷酸（3学时）第12章酶制剂发酵工艺（3学时）第13章研究进展和课程总结（2学时）发酵工艺学2019/12/18第五章生产菌种的制备与保藏第一节生产菌种的制备过程第二节生产菌种的质量保证第三节生产菌种的保藏2019/12/18种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备发酵工程的工艺流程废弃物资源化、无害化产品课程导入2019/12/18发酵工程实验室摇瓶-小试-中试5L小试5L-50L二级发酵装置课程导入2019/12/18本节课的重点和难点本节课的重点1、种子制备过程2、种子质量的控制措施本节课的难点影响种子质量的因素2019/12/181种子扩大培养的概念2菌种扩大培养的任务3种子制备的过程4发酵工业种子培养方法第一节生产菌种的制备过程返回请点我呀2019/12/181.1种子扩大培养的概念指保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入固体试管斜面活化后，再经过摇瓶或静置培养，以及种子罐逐级扩大培养而获得发酵产量高、生产性能稳定、数量充足、不被杂菌和噬菌体污染的生产菌种的纯种制备过程。该纯种培养物称为种子。第一节生产菌种的制备过程2019/12/181.1种子扩大培养的概念发酵工业生产过程中的种子必须满足的条件1)菌体的纯种培养物总量适宜，以保证在发酵罐中有适当的接种量；2）微生物菌种的生命力旺盛，移接到发酵罐中后能够迅速生长，利于缩短延滞期，提高设备的利用率；3）菌种能保持稳定的生产性能，生理状态稳定；4）无杂菌和噬菌体的污染。第一节生产菌种的制备过程2019/12/181.2菌种扩大培养的任务其任务：要为每只发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。抗生素类产品的生产采用放线菌，一般采用三级或四级种子扩大培养；谷氨酸等氨基酸产品，以及部分酶制剂类产品生产，采用细菌，采用二级种子扩大培养。第一节生产菌种的制备过程2019/12/181.3种子制备的过程(P118)砂土管孢子冷冻干燥孢子斜面培养摇瓶液体培养茄子瓶斜面培养固体培养基培养实验室种子培养阶段二级种子罐培养一级种子罐培养生产车间种子制备阶段（四级种子罐培养）发酵罐（三级种子罐培养）种子扩大培养的工艺流程第一节生产菌种的制备过程2019/12/181.3种子制备的过程一、实验室种子的制备1）孢子的制备细胞孢子的制备：细胞的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，培养温度一般为37℃，时间为1-2d，产芽胞的则需5-10d。霉菌孢子的制备：一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然产品为培养基，培养温度一般为25-28℃，时间为4-14d。放线菌孢子的制备：一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，培养温度一般为28℃，时间为5-14d。第一节生产菌种的制备过程2019/12/181.3种子制备的过程一、实验室种子的制备2）液体种子的制备好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种试管三角烧瓶摇床种子罐。厌氧培养：对于酵母菌(啤酒、葡萄酒、清酒等）试管三角烧瓶卡式罐种子罐。第一节生产菌种的制备过程2019/12/18例：啤酒酵母(P120)4℃保存于麦芽琼脂或MYPG培养基菌种10mL麦芽汁的500-1000mL三角瓶250-500mL麦芽汁的500-1000mL三角瓶5-10L麦芽汁的卡式罐25℃，2-3d25℃，2d，定时摇动或通气15-20℃，3-5d麦芽汁的发酵罐2019/12/181.3种子制备的过程二、生产车间种子制备1）种子罐的作用便孢子发芽，生长繁殖成菌丝体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。2）种子罐级数的确定种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，主要取决于两方面：①菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；②所采用发酵罐的容积。第一节生产菌种的制备过程2019/12/181.3种子制备的过程2）种子罐级数的确定细菌生长快，种子用量比例少，级数也较少，如谷氨酸等氨基酸类产品以及部分酶制剂类产品可用2级发酵，即：茄子瓶→种子罐→发酵罐。霉菌生长较慢，如青霉菌，可用3级发酵，即：孢子悬浮液→1级种子罐（27℃，40h孢子发芽，产生菌丝）→2级种子罐（27℃，10～24h，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐。放线菌的细胞生长繁殖缓慢，如抗生素类产品，一般采用3级或4级种子扩大培养。酵母生长比细菌慢，比霉菌和放线菌快，通常用3级种子。如啤酒酵母的扩大培养，扩大倍数一般第1级到第2级为8~10倍，第2级到第3级为4~6倍。第一节生产菌种的制备过程二、生产车间种子制备2019/12/18二、生产车间种子制备3）确定种子罐级数需注意的问题A：种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会。B：种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌的机会。C：虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选出用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。第一节生产菌种的制备过程2019/12/181.4发酵工业种子培养方法1）种子扩大培养的方法：表面培养法、固体培养法（曲法培养）、液体深层培养法、载体培养法。2）深层培养法的基本操作控制点：灭菌、温度控制、通气与搅拌。3）常用的液体深层培养法：放大法、两步法、控制培养法、分批培养法（间歇发酵法）、连续培养法（连续发酵法）、补料分批培养法（流加法）。第一节生产菌种的制备过程2019/12/18第五章生产菌种的制备与保藏第一节生产菌种的制备过程第二节生产菌种的质量保证第三节生产菌种的保藏2019/12/181、种子质量的判定（1）pH；（2）培养基灭菌后糖、氨基酸、磷等的含量；（3）显微镜下观察菌丝形态、菌丝浓度和培养液的外观色泽和颗粒等；（4）其他参数，主要酶活力、产品含量等。第二节生产菌种的质量保证2019/12/182、影响种子质量的因素(P121)（1）培养基（2）培养温度和湿度（3）培养时间(种龄)（4）接种量（5）通气和搅拌（6）泡沫（7）染菌的控制（8）种子罐级数第二节生产菌种的质量保证2019/12/18种龄/h种龄与碱性蛋白酶活力之间的关系酶活力/（U/mL）接种量/%酶活力/（U/mL）接种量对碱性蛋白酶产生的影响81216201367910008006004001400120010008002019/12/183、种子异常的分析（1）菌种生长发育缓慢或过快（2）菌丝结团（3）菌丝粘壁第二节生产菌种的质量保证2019/12/184、种子质量的控制措施（1）菌种稳定性的检查方法：将保藏菌株溶于无菌的生埋盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。（2）无杂菌检查在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。方法：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等。2019/12/185、种子质量标准（1）细胞或菌体（菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观）单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。（2）生化指标：种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化（3）产物生成量：在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。（4）酶活力：种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定关系。2019/12/18第五章生产菌种的制备与保藏第一节生产菌种的制备过程第二节生产菌种的质量保证第三节生产菌种的保藏2019/12/18第三节菌种保藏的原理和方法2019/12/18提纲菌种保藏的目的和意义菌种保藏的原理和方法斜面保藏法和穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法液氮保藏法菌种复壮种子扩大培养2019/12/18菌种保藏的目的和意义目的意义：保持优良菌种优良性状的稳定，满足生产的实际需要。优良菌种丢失（退化）的原因：世代短、易变异、易污染、死亡。菌种保藏机构：世界现有700多家专门机构。措施：创造条件，使微生物处于休眠状态，减少变异。低营养、低温、干燥、缺氧→低代谢、低生长2019/12/18菌种保藏的原理和方法菌种保藏(Cultureconservation)原理挑选优良的菌种，最好是休眠体创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）菌种保藏方法斜面(Slant)低温保藏法传代培养，六个月砂土管保藏法适用范围广，两年冷冻干燥(Freez-drying)保藏法长达十年液氮超低温保藏法（-130℃）(Liquidnitrogenultra-lowtemperaturestorage)2019/12/18一、斜面保藏法和穿刺保藏法1.斜面保藏法：（短期，3-6个月）范围：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌方法：适宜培养基→适温培养→冰箱保藏（4-5℃）→到期转种优点：设备、方法简单缺点：转代多，易变异；污染机会多2019/12/18一、斜面保藏法和穿刺保藏法2.穿刺保藏法：（好气菌，6-12个月）方法：小试管或螺口管→1﹪琼脂培养基→接种针穿刺→培养→盖2-3mm无菌液体石蜡→冰箱保藏范围：细菌、放线菌、丝状真菌优点：范围较广，简便实用缺点：不适用能利用石蜡为碳源的微生物；不同种类，保藏期差异较大。2019/12/18二、沙土管干燥保藏法范围：产孢子的放线菌和丝状真菌，形成芽孢的细菌。方法：沙、土分别洗净→烘干、过筛（80-100目）→1-2︰1沙土混合、装管1cm→121℃灭菌2-3次→无菌检验→烘干备用→孢子或悬液与沙土混匀→真空抽干→封口（熔封、石蜡封）→干燥器中于冰箱5℃保藏特点：设备简单，方法较繁，效果较好（长，2年，有长达10年），但范围受限制。2019/12/18三、真空冷冻干燥保藏法方法：1.安瓶管处理：8-10×100-150mm，浸洗、烘干、盖口；灭菌、干燥（60℃）。2.保护剂：减少冷冻干燥对微生物的损伤，常用脱脂牛奶、血清（适当方法灭菌）。3.菌悬液制备：斜面→加保护剂→制悬液→吸入安管4.冷冻干燥：快冷至-15--30℃，抽真空，15分钟内达到66.661Pa；升到13.3322Pa，升温至20-30℃；真空封口。5.安瓶管保藏：4-5℃，5-10年。（样品含水量1-3％）2019/12/18四、液氮保藏法方法：①浓菌悬液→加保护剂→装安管0.2-1cm→封口②降温（1℃/min）至-25℃，入液氮罐，-150—-196℃保藏。③取出时，应于温水（38-40℃）中震荡1-2min。特点：效果好（2-3年，长达9年），方法简单，保藏对象广泛。20