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第五章细胞融合一细胞融合的定义细胞融合是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术。细胞融合(Cellfusion)又称体细胞杂交(Somatichybridization)，是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞)相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。二.细胞融合的意义1.通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。可把这种技术应用于遗传性状改良、克服远缘杂交中的不亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的新品种。2.进行体细胞融合可以避开生殖细胞的受精过程，从而在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。3.体细胞融合还有一个重要的价值，就是创造细胞质杂种。在体细胞杂交中双亲的细胞质都有一定的贡献。据试验，融合后的杂种细胞质最终会选择某一亲本的叶绿体，但线粒体可以实现双亲重组。因此，有可能通过细胞融合获得细胞核、叶绿体、线粒体基因组的不同组合，这在育种上无疑有着重大价值。4.体细胞杂交在作物育种和种质创新上有其独到的意义和作用。随着新的融合技术(如电融合技术)进一步完善和发展，体细胞杂交对作物改良必将发挥出更大的作用。三基本原理对于植物细胞而言，1、一般先将两种不同植物的体细胞(来自其叶或根)经过纤维素酶、果胶酶消化，除去其细胞壁，得到原生质体；２、而后通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞；３、继而再以适当的技术进行杂种细胞的分检和培养，促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的转移。４、由于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是一个新的物种或品系。下图所示的是两个不同的原生质体或细胞融合成一个新的融合细胞的原理示意图：将不同来源的两个原生质体或细胞通过细胞融合，得到含有两者遗传信息的新的杂合细胞，然后通过培养基筛选出这种杂合细胞，就有可能得到一个新生物。植物细胞融合过程示意图:显微镜下的细胞融合过程见图5-2细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合几个步骤。其中细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步，融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的具体变化过程图解如图5-3所示。细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。后来，细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞。四融合材料（一）植物或微生物原生质体的制备植物和许多微生物细胞外有一层坚韧的细胞壁，如植物细胞质膜外面包裹一层细胞壁，各细胞壁间有果胶层将细胞联结在一起。为了促使这样细胞的融合就必须先得到单个细胞，除去细胞壁，才能获得植物原生质体或微生物原生质球。因此对于植物和微生物细胞的融合一般又可称为原生质体融合。（二）动物单个细胞的获得动物细胞虽然没有细胞壁，但细胞间的连接方式多样而复杂，在进行有效的细胞融合之前，也必须获得单个分散的细胞。主要步骤如下：1.组织的获得采用各种适宜的方法处死动物，取出组织块放入小烧杯中，用剪刀将组织块剪碎成lmm3大小，用吸管吸取Hanks溶液冲下剪刀上的碎块，补加3-5ml的Hanks溶液，用吸管轻轻吹打，低速离心，弃去上清液，留下组织块。2.组织的消化通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。可根据不同的组织对象采用不同的酶消化液，如最常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。其他的酶如链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物组织的消化。EDTA最适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶使用。下面分别以胰蛋白酶和胶原酶为例介绍一下动物组织的消化方法：胰蛋白酶：尤其适合于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾以及传代细胞等。用胰蛋白酶消化动物细胞的基本步骤如下：(1)向剪碎的组织块中加入30-50倍体积的0.25％浓度的胰蛋白酶。(2)在37℃水浴内消化30~60min，每5-l0min摇动一次，根据具体情况可以中间更换消化液。(3)Hanks液漂洗两次，每次2~3min。(4)800r／min离心5min，弃上清液，加入营养液。如果有大块，可用纱网过滤。胶原酶：是一种由细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等。胶原酶不受Ca2+、Mg2+的螯合影响，可用BSS和含血清培养基配制成200U／ml或0.1~0.3mg／ml浓度，作用温和，无需机械振荡。具体消化方法如下：(1)向培养瓶中放入1~5mm3大小的组织块，加5m12000U／ml的胶原酶母液，最终浓度为200U／ml，pH=6.5。(2)36.5℃水浴4~48h，无需摇动，中间可更换酶液一次。(3)当组织变软，分散于瓶底时，轻轻振荡即散成细胞团或单个细胞，小心倒出培养液。(4)800r／min离心5min，弃上清液，重新悬浮BSS溶液中，再离心一次。(5)加入培养液制成细胞悬浮液。五细胞融合技术为了使制备好的原生质体或细胞能融合在一起，选择适宜有效的诱导融合方法很重要。诱导融合的方法可分为物理法、化学法及生物法。物理法主要包括显微操作、电场刺激等；化学法主要是用聚乙二醇PEG结合高pH、高钙离子法；生物法有仙台病毒法等。具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。诱导动物细胞融合，仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合法都适用；植物细胞融合常用PEG法和电融合法；微生物细胞融合只适用PEG法。表5-1显示不同细胞融合的条件及其主要应用。（一）生物法——仙台病毒法我们知道很多病毒都具有凝集细胞的能力，它一边黏接在一个细胞表面，另外一边黏接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。在动物细胞融合中，仙台病毒(HVJ)已成为产生细胞杂种的标准融合剂。病毒促使细胞融合的主要步骤如下：(1)两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。(2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透。(3)两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体。(4)进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。过程图解如下图所示。（二）化学法——PEG结合高Ca2+、pH诱导法细胞融合中的化学法诱导主要包括：NaNO3诱导(NaNO3可中和原生质体表面负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率低)、高Ca2+和pH诱导法、PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。上面几种方法中以后者最为常用，下面做一重点介绍：1.基本原理聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2—CH2)nOH，商品名卡波蜡(Carbowax)。实验室用的PEG平均相对分子质量在200-20000之间，一般1000以下者为液体，1000以上者为固体。1974年人们用它诱导大麦、大豆等植物原生质体融合，以后又用PEG诱导与用高Ca2+和pH诱导相结合，极大地提高了融合效率。2.基本过程以植物原生质体为例，PEG法诱导原生质体融合的过程见图5-4所示。融合中应注意：(1)事先要做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。(2)原生质体的密度应在105个／ml左右，两种原生质体按1:1等量混合。(3)常用PEG的分子量通常为4000~6000，加热熔化与Eagle溶液配成50％(W／V)浓度(小分子质量的PEG配成55％浓度)。加入PEG后，24℃培育10-20min(注意时间宜短不宜长，过长，使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低融合率)，缓缓加入高pH、高钙离子溶液，15min后用冲洗液清洗，离心收集原生质体。(4)计算：融合率=(融合细胞的细胞核总数／视野内全部细胞的细胞核总数)×100％(三)物理法——电融合诱导法1基本原理电融合法是20世纪80年代出现的细胞融合技术。在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。与PEG法比较，电融合法优点较多，如融合率高、重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。电融合设备及原理如图5-5：2基本过程电融合装置的电极有两种：微电极型(图5—5中B)和平行多电极型(图5-5中A)，它们的特点与操作如下：(1)将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室中，微电极型只有一个小室(图5-5中B)，平行电极型有4个小室(图5-5中A)，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中。(2)微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜表面接触，微电极所产生的5~12mA的脉冲电流间断刺激1~5ms，原生质体在累计几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体，整个过程大约10~30min。(3)平行多电极通过1兆赫(MHz)交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状(图5-5中C)。在适当时间和强度(如50mAl.2~2kV／cm)的直流电脉冲作用下，质膜被击穿，进一步形成融合体。应用如下图所示。(四)细胞融合的影响因素1.植物细胞融合植物原生质体融合无种属特异性，故其融合效率仅与外界条件有关，而与其自身种属无关。如何确定不同材料的融合条件，需经过具体实验制定出最佳融合方案。植物细胞融合的影响因素如下：(1)PEG诱导融合的关键是作用时间，尤其是高Ca2+和pH溶液处理时间长短非常重要。时间过长原生质体损伤严重，融合效率降低；过短则不融合。(2)PEG规格和纯度与融合效率亦有关系。以往认为PEG分子质量越大，对细胞毒性越大，因此选用分子质量小的PEG。但是目前发现PEG毒性是其中杂质所致，经纯化后即无毒性。故目前应用分子质量较大者(4000~6000)居多。因此操作时应注意PEG纯度。(3)在电场诱导融合时，融合率与原生质体密度有关；密度小于104个／ml融合效率低；大于105个／ml会融合成团，难以达到预期效果。最适宜的密度一般为2×104~8×104个／ml。(4)在融合液中加入少量CaCl2，既可维持一定电导率，对细胞也有保护作用；其次交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲大小均会影响融合率。(5)此外，用混合盐溶液对原生质体进行融合前预处理，以及在促融剂中添加伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜、胰蛋白酶、精胺或亚精胺等亦可提高融合效率。2.动物细胞融合在动物细胞融合过程中，除促融剂外，其他如细胞性质、温度、pH、离子强度及离子种类等均会影响细胞融合效率。(1)首先，亲本细胞表面性质影响较大，表面覆盖绒毛而不规则者较易融合，而表面光滑者较难融合。(2)细胞种类不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。(3)细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧利希氏腹水癌细胞融合时，于37℃振摇时易于融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34℃振摇则融合率下降。在37℃时不振摇则几乎不融合。(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20％时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+，但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol／L。(6)最适合的pH为7.4~7.8之间，在此范围之外，融合率均较低。六.融合细胞的选择通过各种技术手段可以获得各种类型的融合体。细胞发生融合后，根据融合细胞中所含的类型，可将其分为以下几种类型：(1)同核体——同源原生质体的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一样。(2)异核体——非同源原生质体的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲核杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也有可育的，如烟草种间的细胞杂种。(3)多核体——