第7章4分子筛.

凝胶层析凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。发现历史PerFlodin,JerkerPorathandBjörnIngelman1941年Ingelman意外发现了葡聚糖dextran。1957年，Porath在葡聚糖柱中发现了分子筛现象。1959年，Pharmacia推出SephadexG-25和G50凝胶过滤填料。2004年，Pharmacia并入GE。1.基本原理当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢（分子筛效应），从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。一、凝胶过滤层析概述分子筛效应样品流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子直径较大，不易进入凝胶微孔，所以向下移动的速度较快。小分子可以进入凝胶微孔，在向下移动的过程中，从一个颗粒内扩散到间隙后再进入另一颗粒，如此不断地进入和扩散，导致小分子的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中大的分子先流出色谱柱，中等的分子后流出，小分子最后流出，这种现象叫分子筛效应。2.凝胶过滤层析的特点1.设备简单，操作方便，只需一种缓冲液；2.根据分子大小和形状分离；3.生物大分子可测定其分子量大小；4.分离条件缓和，应用广泛；5.分辨率不高，样品被稀释。113.目标组分的分子量、形状关于GF分级范围凝胶的分级范围（渗入限与排阻限）相对分子量分级范围上限——全排阻分子，流程最短，无法分离相对分子量分级范围下限——全渗透分子，流程最长，无法分离分级范围下限相对分子量分级范围上限——部分渗透分子，流程长短不一，有效分离134.层析柱的重要参数凝胶柱体积参数Vt=Vo+Vi+Vg19洗脱体积Ve＝Vo＋Kd·ViKd—溶质分子在固定相与流动相之间的分配系数，只与颗粒大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。21Ve＝Vo＋Kd·ViKd=0，全排阻分子，Ve=Vo；Kd=1，全渗透分子，Ve=Vo+Vi0Kd1，部分渗透分子，VoVeVo+Vi分级分离—部分渗透分子之间的分离；组别分离（分类分离）—不同类别分子间的分离，全排-全渗-部分渗透GF分离中的两种类型：一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering22GF分辨率分辨率（分离度）Rs用于描述混合组分中两种物质组分间分离效果的好坏，定义为相邻两峰洗脱体积（保留值）之差与两峰底宽平均值之比，12121212)(22bbeebbeesWWVVWWVVRAnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering23如要提高分辨率，只能从选择性和柱效进行考虑!选择性：柱系统分离大小不同组分的能力。习惯上用相对保留值α表示，取决于凝胶介质的分级范围、渗透性等特性。oeoeVVVV12当=1时，Ve2=Ve1，无论如何两种组分是无法分开的。AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering24表现为两组分洗脱体积的差异，Ve差值越大，选择性越好AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering25柱效1.以特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示塔板理论认为，一根柱子可以分为N段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。理论塔板数（N）可根据色谱图上所测得的洗脱体积和半峰宽按下式推算：2)(54.5heWVNVe—洗脱体积；Wh—半峰高时的峰宽一般说来，色谱柱的理论塔板数越大，表示组分在色谱柱中达到分配平衡的次数越多，越有利于分离；柱效表现为洗脱峰的宽度，洗脱峰越窄，柱效越高（N越大）。AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering26理论塔板高度HNLH/式中L为柱长，N为理论塔板数，理论塔板高度H固定时，L增加，则N增加，柱效越高。固相介质：凝胶颗粒（多孔的网状结构）交联度或孔度（网孔大小）——凝胶的分级分离范围交联葡聚糖——SephadexG（1500-30000）琼脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺——Bio-GelP二.凝胶过滤介质AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering28凝胶过滤介质的基本结构介质的结构和性质直接决定分离效果和效率分级范围多孔性粒度NRsAnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering29凝胶过滤介质的参数及性质基本参数粒度5~400μm范围小粒度—柱效高，但背景压力大，设备要求高，分析型大粒度—柱效低，压力小，样品量大，制备型粒度均一——分离效果好AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering30交联度、网孔结构、机械强度•交联度高，颗粒网孔小，机械强度高•膨胀度：每克干胶溶胀过程中吸收水的体积ml/g，也称得水值•交联度高，得水值越小（水分子无法大量进入颗粒网孔之间）机械强度与交联度呈正相关AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering31物化稳定性耐酸碱、去污剂、高温等外界分离条件下文按照以上几个主要反映凝胶过滤介质性质的指标介绍主要的GF介质类型。AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering32凝胶介质的主要类型交联葡聚糖凝胶（Sephadex）基本性质①由数个葡萄糖分子聚合而成的同多糖就是葡聚糖，通过环氧丙烷交联而成交联葡聚糖凝胶。具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering33②葡聚糖凝胶常用G-X代表，SephadexGX，X为凝胶吸水值的10倍；SephadexGX，X—每10g干胶的得水值（ml/10g）种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200。如G-25表示1g干凝胶的吸水量为2.5mL，G-100表示1g干胶持水10mL，依次类推。SephadexGXAnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering34③X数字既代表持水量（得水值），也代表交联度，也能反映膨胀程度和分级范围。X数字越小，得水值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，得水值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大，适用于分离高分子生化产品。AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering35AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering36特点•较强的亲水性•溶胀、浸泡时沸水（脱气）、轻搅（防裂）•葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解•湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering37•SephadeXLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤•机械强度低，G100、150、200属于软胶，高压易破裂SephadeXLH—20AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering38琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用。琼脂糖凝胶（Sepharose）AnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering39Sepharose•无交联剂，Sepharose2B、4B、6B，数字代表琼脂糖含量，含量高则强度高，分级范围变小•pH4-9范围内的盐溶液稳定•40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理SepharoseAnhuiUniversityofTechnologyandScienceTeachingandResearchSection·DepartmentofBiochemicalEngineering40补充：瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。美国的为Bio－GA，有6个型号，即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。英国的称为Sagavac，又分为Sagavac2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状