第7章蛋白质的分离纯化和表征.

第7章蛋白质的分离纯化和表征蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性碱/酸越大——pI越大•pI通常在6.0左右一、蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿之间1道尔顿＝1×C12绝对质量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白质分子的大小（一）根据化学组成测定最小分子量1、测定蛋白质中某一微量元素的含量2、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量=100*55.8/铁的百分含量（二）SDS－PAGE测定相对分子质量蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于：所带电荷分子量分子形状十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键（三）凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质混合样凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质（二）蛋白质的沉淀Pr从胶体溶液中析出Ⅰ可逆沉淀：–温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷–Pr结构和性质没有变化–适当条件下可重新溶解——非变性沉淀•pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等不可逆沉淀•强烈沉淀条件•破坏Pr胶体溶液稳定性•也破坏Pr结构和性质•沉淀不能再重新溶解——变性沉淀•如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等Ⅱ1.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性•等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶•原因？盐溶—盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶盐析•向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出•原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（（NH4）2SO4）2.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用3.等电点沉淀4.重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.生物碱试剂和某些酸类沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态四、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法1、透析和超过滤利用蛋白质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液加压血液2、密度梯度（区带）离心60000~80000转/分重力60万～80万倍3、凝胶过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀调整溶液pH不同蛋白在各自pI处依次沉淀2.盐溶和盐析3.有机溶剂分级分离法降低介电常数争夺水化膜（三)根据电荷不同的分离方法—电泳原理：•蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0•分子大小不同，电场中移动速度也不同等电聚焦电泳双向电泳离子交换层析（四）利用蛋白质选择性吸附的性质•羟磷石灰层析•疏水作用层析（五）利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒具有极强的专一性六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（略）