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骨髓间充质干细胞对肝豆状核变性肝纤维化治疗的临床研究脑科医院肝豆状核变性病区张东锋主要研究开发内容本研究采用分组对照临床试验方法，对骨髓间充质干细胞治疗HLD肝纤维化的安全性和有效性进行评价检测多种肝纤维化指标及肝组织形态学病理改变；以观察自体骨髓间充质干细胞移植对肝纤维化病理进程的影响为开展间充质干细胞治疗HLD肝纤维化提供试验依据申请项目的必要性和依据概述肝豆状核变性（Hepatolenticulardegeneration，HLD）又称Wilson病（Wilsondisease，WD），是一种难治性的常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病由于铜在肝、脑等组织中异常沉积引起相应器官组织损伤，临床以肝硬化、脑损害等相关症状为主要表现临床症状复杂多样，但所有患者由于铜离子自胆道排泄障碍，造成游离铜在肝组织长期缓慢蓄积导致不同程度的肝脏慢性损害，肝纤维化几乎是每一个HLD患者肝脏的主要病理改变HLD流行病学调查本病是较为常见的单基因遗传病，国外FerenciP等流行病学调查，本病发病率为1/3万人，患病率为15~25/10万人，杂合子为1/100人国内刘焯霖等对1982～1991年神经遗传性疾病专科门诊统计分析，结果HLD占10.14％，居全部单基因遗传病的第二位我院统计2010年7月～2011年2月期间427例住院患者，约70%的患者在院外由于误诊误治导致病情加重，甚至因为肝硬化失代偿或/及严重脑损害导致残疾和死亡申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据FerenciP等胡纪源等杨任民等HLD的病理研究证实患者均存在明显的肝脏损害绝大多数HLD患者存在着不同程度的肝纤维化声像学改变HLD的肝纤维化是患者最常见的病理改变肝硬化失代偿是本病患者致残、致死的最主要原因我们认为非常有必要对HLD的肝纤维化进行系统研究研究证实HLD患者均存在明显的肝脏损害×干预申请项目的必要性和依据肝纤维化的病理机制肝纤维化的形成涉及致病机体反应的多个方面反应细胞细胞因子细胞过量表达产物以及降解酶等复杂的细胞及分子机制ECM合成增加ECM降解减少致病因子使肝组织中窦内皮细胞肝细胞等形成复杂的细胞-细胞因子网络肝星状细胞激活这些物质常被用作检测肝纤维化水平的血清标志物HALNPC-ⅢIV-CECM可被基质金属蛋白酶（MMPs）降解基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)阻止肝脏ECM的降解肝纤维化吕有魁等临床观察到多数HLD患者上述指标明显升高刘焯霖等观察到儿童HLD肝组织内TIMP-1、TIMP-2表达量增强国内外有关文献在治疗HLD肝纤维化现状国内外有关文献在治疗HLD肝纤维化尚属空白，已报导的药物尚无一种被正式批准应用于临床抗肝纤维化，这是因为申请项目的必要性和依据某些药物虽具有抗肝纤维化作用，但其靶向性不强，对其它组织也有影响，长期应用副作用大许多药物早期或短期有预防作用，对已形成的肝纤维化疗效并不明显某些药物在某一环节有抗肝纤维化效果，但在其它环节又促进纤维化矛盾的作用寻找有效治疗HLD肝纤维化的途径任重而道远却又迫在眉睫干细胞干预肝纤维化的研究现状申请项目的必要性和依据Peresen等HigashiyamaR等Sakaida等Aziz等骨髓间充质干细胞及肝星状细胞，可诱导活化的肝星状细胞凋亡，明显减少胶原沉积骨髓干细胞定植于肝脏，一部分表达基质金属蛋白酶，促进纤维条索的溶解而发挥抗纤维作用骨髓干细胞移至肝脏纤维条索周围分泌MMP-2、914增多细胞外基质及胶原条索降解增多有利肝功改善通过将MSCs由尾静脉注入肝纤维化模型鼠内发现MSCs具有向肝细胞方向的转化及减轻肝纤维化的功能MSCs移植具有抗肝纤维化作用骨髓间充质干细胞治疗肝损害的优势骨髓间充质干细胞取材方便，来源丰富分化能力强免疫原性低没有伦理学障碍，不受道德及法律方面的限制具有跨胚层向多组织细胞分化的潜能和自我更新的高增值能力。申请项目的必要性和依据本课题意义骨髓来源的间充质干细胞治疗肝豆状核变性导致的肝纤维化的安全性和有效性还需进一步的评估探讨骨髓间充质干细胞移植治疗该病肝纤维化的机制也具有重要的意义申请项目的必要性和依据实施方案采用临床试验方法，将病人分为三组:青霉胺组骨髓间充质干细胞移植干预组;骨髓间充质干细胞移植干预加青霉胺组。随访1-2年；治疗后3、6、9、12个月观察患者日常生活能力评价、临床分级评价、细胞因子、基质金属蛋白酶、肝铜含量变化、治疗1年后肝组织活检进行病理检查，所得数据应用SAS处理。项目研究开发内容给药方案青霉胺组：青霉胺(上海信谊制药公司生产)，剂量为每日40mg/kg，连续8～16周骨髓间充质干细胞移植干预：将3×l06细胞/ml的骨髓间充质干细胞液2ml+生理盐水100ml经静脉移入人体。每10天静脉干细胞移植一次，三次为一个疗程骨髓间充质干细胞移植干预加青霉胺组：将3×l06细胞/ml的骨髓间充质干细胞液2m+生理盐水100ml经静脉移入人体，每10天静脉干细胞移植一次，三次为一个疗程。另将青霉胺（剂量为每日40mg/kg），每日分3次口服，连续8～16周项目研究开发内容标本收集分别于治疗后3、6、9、12个月抽取病人外周血1.2ml，用于细胞因子、基质金属蛋白酶、肝铜含量检测；治疗后1年进行肝脏组织病理检查项目研究开发内容观察指标与方法取血1.2ml，血标本经低速冷冻离心(3000转/分)10分钟后取血清约0.5ml进行有关实验项目检测。如：血清生化、肝纤维化指标及相关细胞因子检测血清铜蓝蛋白采用免疫比浊法，ALT采用比色法，LN、HA采用放射免疫法(RIA)，PDGF、TGFβ1、IL-10、TNF-α、MMP-1及TIMP-1采用ELISA法肝脏组织病理检查:肝脏标本均作连续切片，每份标本均行下述检查：普通HE染色、胶原纤维采用Masson氏染色、网状纤维采用Gomori染色肝脏组织铜含量测定采用原子吸收分光光度法检测项目研究开发内容统计学分析数据应用SAS处理，各组间比较采用onewayANOVA分析项目研究开发内容关键技术肝脏穿刺可能会给病人带来一定的痛苦和创伤，我们将请有经验的临床医生在彩超监测下进行活检建立一套稳定的检测细胞因子、基质金属蛋白酶、肝铜含量方法直关重要。本实验室检测基质金属蛋白酶时，出现不稳定的现象，对于这一问题，我们正请有关专家帮助建立稳定、可靠的方法项目研究开发内容技术路线项目研究开发内容本项目的特色与创新之处首次应用人骨髓干细胞移植干预HLD患者，为开展骨髓干细胞移植治疗HLD肝纤维化提供新的理论、实验依据项目研究开发内容已具备的试验手段南方医科大学附属郑州人民医院2008年成立了院士工作站，并开展了干细胞治疗。与此相适应的投入一千万元建立了一个现代化试验室，配备了先进的试验设备。有能力提供高质量、高活性的细胞该研究与我们刚获得的国家自然基金项目可以共享试验设备和人力资源，我们又投入500多万元，购买了与试验相关的设备，如ABI3730XL序列仪、高速冷冻离心机、流式细胞仪、PCR仪、分子生物学平台、高速离心机、悬涡振荡器，磁力搅拌器，PH计，立式高压消毒锅，微波炉等院士工作站具备完成本课题所需的条件实施本项目已具备的条件已具备的技术力量姓名性别出生年月学历职称（职务）从事专业工作单位及部门张东锋男1976.10硕士主治医师神经内科郑州人民医院、脑科医院曹巍男1963.01博士教授分子病理郑州人民医院、院士工作站王大忠男1968.08硕士副主任医师神经内科郑州人民医院、脑科医院吴牵峰男1973.12硕士主治医师神经内科郑州人民医院、脑科医院刘荣女1975.05博士副研究员药理学郑州人民医院、院士工作站张岩男1983.02学士住院医师神经内科郑州人民医院、脑科医院葛长勇男1970.02博士副研究员干细胞研究郑州人民医院、院士工作站实施本项目已具备的条件项目的预期经济、社会和环境效益通过以下三方面的研究评价骨髓间充质干细胞治疗HLD患者的安全性和有效性（血常规、尿常规、肝肾功能）探讨经人静脉骨髓间充质干细胞移植干预肝纤维化的病理过程观察骨髓间充质干细胞对多种肝纤维化指标、细胞因子、基质金属蛋白酶、肝铜含量的影响及肝组织光镜、电镜的病理改变本项目可取的以下几项成果客观评价骨髓干细胞移植治疗HLD肝纤维化的安全性和有效性。初步探讨骨髓干细胞移植对HLD肝纤维化干预的作用机制。在国内核心期刊发表学术论文1-2篇，SCI杂志发表专业论文1篇。申报省及市级科技进步奖项项目的预期经济、社会和环境效益经费概算资金支出预算预算金额（万元）其中：申请市财政拨款财政拨款支持简要说明1.设备费4酶联免疫阅读仪2.材料费10抗原及酶标记抗体;DNA提取试剂盒；测序试剂等耗材3.测试化验加工费3设备仪器使用费；数据的收集与分析等4.燃料动力费1房屋、水电、暖气、空调等费用5.差旅费1标本的收集、咨询来往交通费用6.会议费0.51-2次相关学术会议7.出版/文献/信息传播/知识产权事务费0.5文章发表、结题、送审、鉴定费用8.劳务费1研究生及临时工补贴9.专家咨询费1邀请专家讲课及咨询费10.管理费1.1管理费按5%计算支出合计23.1