肿瘤干细胞的研究现状

1肿瘤干细胞的研究及治疗摘要:最近提出的肿瘤干细胞学说认为肿瘤起源于干细胞,肿瘤生长是肿瘤组织中极少量具有特殊细胞表面标志的肿瘤干细胞增殖的结果。因此治疗的关键应是针对肿瘤干细胞,通过靶向肿瘤干细胞及其异常调节的信号转导通路来治疗肿瘤。本文重点介绍了关于肿瘤干细胞的理论，研究现状，研究方法以及问题，推测肿瘤干细胞的深入研究将会对今后肿瘤防治产生巨大影响。关键词:肿瘤；肿瘤干细胞。Abstract：Theimplicationofthetumorstemcellhypothesisisthattumororiginsfromthestemcells,andisadiseaseofstemcells.Thegrowthoftumoristheresultofaminorpopulationofcancerstemcells’whichhavethespecialcellsurfacemark.Thereforethekeyoftumortreatmentshouldaimatthetumorstemcells.Inthisreviewwediscussthetheory，developments，methodsandproblemsintheTSCsresearch．ThedevelopmentofTSCsresearchwillgivebiginfluenceonthecancerpreventionandtherapy．KeyWords:tumor;tumorstemcells.目前，有关干细胞的研究已经深入到生命科学的各个领域，在一些疾病的临床诊断和治疗上取得了突破性的进展。所谓“干细胞”是指一种早期未分化细胞，具有自我更新和多向分化潜能的一类细胞。干细胞的研究推动了肿瘤学的发展，研究者发现肿瘤细胞与干细胞有许多相似之处，因此提出了“肿瘤干细胞”理论，并已在白血病、乳腺癌及胶质瘤等肿瘤中分离出了肿瘤干细胞，为肿瘤的研究与治疗开辟了新方向。1.干细胞和肿瘤干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞，分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来自内细胞团，具有向机体各种细胞分化的潜能；成体干细胞能够分化成特定功能的细胞，如造血干细胞能够分化成血液和免疫系统中的各种细胞。正常机体中干细胞数量很少，分化和增殖是平衡的，以维持组织细胞数量稳定。近年来随着对干细胞研究的不断深入，人们发现干细胞与肿瘤细胞之间存在着很多相似的特点[1]：①两者均具有自我更2新和无限增殖能力。②干细胞与TSC均有较高的端粒酶活性。③有不同分化程度的干细胞，也有分化程度不同的肿瘤。④干细胞的迁移和肿瘤细胞的转移都有一定的组织和器官特异性，且二者皆受特异性化学因子及其受体的调节。⑤二者有许多相似的生长调控机制，如Wnt，SI-I2，Notch途径。⑥自我更新越频繁的组织，干细胞自我更新率越快，肿瘤的发生率越高。2.肿瘤干细胞的提出早在l9世纪5O年代，病理学家们发现肿瘤组织与胚胎组织之间具有相似性，认为肿瘤可能起源于胚胎样组织。2O世纪6O年代，研究发现来自小鼠不同的骨髓瘤细胞，在体外能够形成克隆的癌细胞只占0.1%～1%，而且与在体内利用脾脏培养的克隆形成率一致。在白血病细胞移植实验中，也仅有l%～4%的细胞能在脾脏内形成克隆。l977年，Hamburger等发现在人肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤的体外细胞培养实验中，只有0.02%～0.1%的肿瘤细胞能在软琼脂上形成克隆。1994年Lapidot在白血病细胞中通过特异性细胞表面标志分离出具有不断自我更新和维持其恶性显型的细胞，并将其命名为急性粒细胞性白血病干细胞(LeukemicStemCells，LSC)，第1次证实了肿瘤干细胞的存在。2002年，Clarke等首次利用流式细胞仪从乳腺癌中分离培养出表达CD44(黏附分子)、B38—1(乳腺／卵巢特异性标记)和ESA(上皮细胞特异性抗原)的肿瘤干细胞。2003年，Al-Hajj等在建立严重联合免疫缺陷(NOD,SCID)小鼠模型的基础上，利用细胞表面标志物分离出人乳腺癌肿瘤干细胞；Singh和Hemmati等从不同年龄段患者的脑肿瘤中分离出脑肿瘤干细胞，这些细胞表达神经干细胞的分子标志物CD133和Nestin，但缺乏成熟分化细胞的表面标志物，在体外培养时可分化形成肿瘤细胞，与从肿瘤患者中分离得到的肿瘤细胞表型相似。2005年，我国梁慧超等也成功地培育了神经肿瘤干细胞。[2]以上实验都表明，在肿瘤中存在着极少数的具有自我更新和分化成其他组织类型能力的细胞，由此提出了肿瘤干细胞(tumorstemcell，TSC)的概念，即肿瘤干细胞是一些极少数的、具有自我更新潜能的、驱使肿瘤形成的细胞。2肿瘤干细胞形成机制传统理论认为成熟细胞基因突变导致肿瘤的形成，肿瘤的生长指全部肿瘤细胞的生长。但越来越多的实验证明肿瘤的形成是极少数干细胞基因突变累积的过程。另外，干细胞不断分裂的特性，也增加了获得增殖错误的机会。目前认为肿瘤干细胞主要来源于以下2条途径。2．1正常干细胞在特定的分化阶段停止分化或分化失常正常干细胞具有自我更新机制，发生恶化只需获得较少的突变，且存活时间长，有较多机会突变为肿瘤干细胞。调查显示，9O%的人类肿瘤为上皮性肿瘤，上皮组织更新快，在不3断的分裂、分在逆转录病毒的作用下，正常造血干细胞会因为MLLENL基因的变异，突变为恶性干细胞，引发化、增殖过程中，干细胞容易发生突变，并且可将突变传给子代细胞。2．2成熟细胞的去分化某些成熟细胞在代谢过程中可能重新获得自我更新的能力，突变成肿瘤干细胞。如正常造血干细胞表面标志为Lin-CD34+CD38-Thy-1+，而人类淋巴细胞白血病肿瘤干细胞为Lin-CD34+CD38-Thy-1-，二者差别仅在于Thy-1+的表达与否，因此Thy-l-的原始细胞或Thy-1丧失表达的正常造血干细胞都可能经突变成为肿瘤干细胞。最近在分子水平上的研究表明，普通干细胞和肿瘤干细胞的多分化潜能及自我更新特性具有共同的特点，如Polv-comb基因家族中的bim-1的正常表达是维持正常造血干细胞所必需的,而它的过分表达则会使pl9与pl6同时下调，造成血液、肝、骨髓中细胞的成熟障碍，从而引发癌变。[2]3肿瘤干细胞的生物学性状3．1自我更新能力实验证明，Notch信号通路调控造血干细胞的自我更新，通过抑制造血干细胞的特定分化阶段，控制造血干细胞向粒系或淋巴系分化，如果其过度表达可诱导恶性淋巴瘤的产生；Hedgehog信号通道参与早期神经系统发育和毛囊形成的调控，如果其抑制物生成发生突变，信号系统活性增高，就可诱导中枢神经系统肿瘤的形成；另外Patched基因的突变，可引起Gorlin’s综合征和小鼠的小脑肿瘤。但由于自我更新信号转导途径的负反馈机制已经被破坏，故不能有效地调控细胞的更新程度和方向。3．2无限增殖能力一个表皮干细胞在体外适宜的培养条件下可稳定产生约1．7×1038个子代细胞，远超过覆盖于成体体表所需细胞数量。而某些癌细胞株也可以在体外增殖数百代，历时数十年。不同的是，正常干细胞的增殖具有自稳性，其数目保持恒定。特别是哺乳动物，当组织处于稳定状态时，干细胞的分化是不对称的，即一个干细胞产生一个子代干细胞和一个特定分化细胞，其干细胞的总数保持恒定。而肿瘤干细胞无自稳性，且增殖过程中基因复制的错误无法进行修复。3．3多分化潜能性在同一肿瘤组织中，不同的肿瘤细胞分化程度是不同的，分化成熟的肿瘤细胞恶性程度较低，而分化差的肿瘤细胞恶性程度高。还有研究发现，肿瘤在发生转移的过程中，肿瘤干细胞还能分化形成血管及一些血细胞，但所分化成的细胞和器官不能参与机体的正常代谢，4只是一些异常的对机体有害的组织。3．4端粒酶活性端粒酶是含有一段RNA模板的逆转录酶，肿瘤细胞具有端粒酶活性及扩增的端粒重复序列。在正常干细胞的恶性转化实验中发现，端粒酶活性和附加的基因突变是正常干细胞恶性转化的2个必要条件。3．5异质化特性在肿瘤干细胞生长过程中，附加的基因突变作用于肿瘤于细胞，使子代细胞在侵袭能力、生长速度、对激素的反应和对抗癌药物的敏感性等方面表现出差异。[2]4肿瘤干细胞的分离纯化虽然有理论及实验支持肿瘤起源于干细胞的观点，但要证明肿瘤干细胞的存在，区别肿瘤干细胞、成熟肿瘤细胞和正常干细胞，必须把肿瘤干细胞分离纯化成不同的亚细胞群，进行体内外功能的检测。随着技术的进步，利用特异的细胞表面标记，运用荧光活化细胞分选系统(FACS)及磁性活化细胞分选系统(MACS)可以将肿瘤干细胞进行分离纯化，主要步骤分为2步：(1)分别按各细胞表面标志进行细胞群(包括细胞表面分子+与一细胞)的筛选，各细胞群按不同细胞浓度接种到NOD／SCID小鼠，观察肿瘤的生长，比较各组成瘤能力，筛选出优势细胞的表面标志；(2)针对几种优势细胞表面标志进行组合，筛选出各组合的细胞群，各按不同浓度组接种到NOD／SCID小鼠，比较各细胞群成瘤能力，确定目的细胞，进行特定研究。[2]4.1白血病干细胞1997年Bonnet等首次分离并发现了白血病干细胞。在人类急性髓系白血病(AML)的研究中，Bonnet等分离、纯化了CD34+CD38-表型的AML细胞。CD34+CD38-细胞所占比例很少(约占0．2％)，但将这类细胞接种到NOD／SCID(非肥胖型糖尿病／重症联合免疫缺陷)小鼠上，可以产生类似人类的急性粒细胞白血病，而了CD34+CD38-细胞无论其细胞多少均不易形成肿瘤，因此认为，了CD34+CD38-细胞是AML的TSC。AML的TSC与正常造血干细胞有相似的细胞表型，前者了CD34+CD38-Thy-1-，后者是了CD34+CD38-Thy-1+。目前认为，突变可能发生于表达Thy-1-的祖细胞或丢失Thy-1+的正常造血干细胞。4.2乳腺癌干细胞实体瘤干细胞最早见于乳腺癌干细胞的分离成功。A1-Hajj等建立了NOD／SCID移植动物模型，结合流式细胞分选技术，利用细胞表面标志物在乳腺癌患者切除标本制成的单细胞悬5液中分选出不同的乳腺癌细胞亚群。进一步细胞移植实验表明，Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞具有干细胞样生长特性，能够无限增殖，并分化产生多种类型的细胞，这类细胞虽然只占乳腺癌的2％，但只需200个即可在小鼠乳腺中形成肿瘤；而Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞不能形成肿瘤。Al-Hajj等接下来用Lin-ESA+CD44+CD24-/low的细胞免疫NOD／SCID小鼠，发现新形成的肿瘤与原来肿瘤的表型异质性相似，而且仅Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞具有致瘤源性。4.3脑肿瘤干细胞Sign等在脑肿瘤中分离出CD133+的脑瘤细胞，发现只有CD133+的肿瘤细胞才能够在体外培养中形成肿瘤球，这种肿瘤球不贴壁，并且能不断增殖分化及自我更新，更重要的是肿瘤球没有已分化成熟的神经细胞的标志。占肿瘤细胞大部分的标志为CD133-的肿瘤细胞表现为贴壁，丧失增生及分化能力，而cD也是正常神经干细胞的标志。Dirks等将在脑肿瘤中分离出CD133+CD133-的脑瘤细胞分别移植到NOD／SCID小鼠的大脑中。100个CD133+肿瘤细胞就可以引起小鼠中肿瘤的形成，而105个CD133-细胞却不能形成肿瘤。通过一系列的免疫组化显示，CD133+形成的肿瘤的细胞显型与原位肿瘤是一样的。这些研究结果提示,CD133+脑瘤细胞是分化形成胶质细胞瘤的TSC。4.4SP细胞由于多数干细胞表面有ABCtransporterBcrpl／ABCG2的存在，能够将外源性的染料(Hoeschstdye33342)转运出细胞而自身不被染色，普通细胞表面没有这种转运蛋白的存在而被染色。这种通过外源染料拒染的方法鉴定出的细胞群为“侧群”(sidepopulation)。Kondo采用流式细胞仪从C6神经胶质瘤细胞系中成功分离了事先标记的SP细胞群，体外无血清培养能产生SP和非SP细胞，并在体内外能产生神经元胶质细胞，发现该细胞群是肿瘤细胞系