胶原蛋白酶的研究进展

1胶原蛋白酶的研究进展三亿文库设为首页收藏本站首页考试资料幻灯片工程技术公务员考试小学教学中学教学大学教学外语资料36胶原蛋白酶的研究进展胶原蛋白酶的研究进展；摘要：胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸；关键词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素；Abstract:Thenutritionala；Keywords:collagenproteas；胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是；加［4］［1－3］和生物活性等特性，被愈来愈多的；[5-6]抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展胶原蛋白酶的研究进展摘要：胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸收，将胶原蛋白水解为胶原多肽后，可显著提高其营养及生理功能，胶原蛋白酶是一种价值很高的蛋白酶种。本文介绍了胶原蛋白酶的定义、选择、影响因素。作用机理等，并展望其研究方向。关键词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素Abstract:Thenutritionalandphysiologicalfunctionofcollagenproteincanbesignificantlyimprovedviachemicalorenzymatichydrolysis，asthecollagenproteinwasdifficulttobeabsorbedbyhumanbodyduetothetriplehelicalcharacteristicmoleculesstructure.Collagenproteaseisakindofhighvalueofprotease.Inthispaper,introducesthedefinitionofcollagenenzyme,selection,influencefactors,mechanismetc.Thefuturedevelopmentdirectionitwasalsoprospected.Keywords:collagenprotease,mechanism,influencefactors胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是一种与组织和器官功能密切相关的功能性蛋白。胶原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性加［4］［1－3］和生物活性等特性，被愈来愈多的消费者所认识。胶原蛋白制品已被广泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域，市场需求急剧增。天然胶原蛋白经蛋白酶水解后，可得到具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节、激素调节、[5-6]抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展前景的功能因子，也是当前医药、食品界最热门的研究课题之一。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低[7]。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白质消化吸收率几乎达100％，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等[8]。寻找一种高效的降解胶原蛋白的酶也成为了当今的一个热门课题。1胶原蛋白酶的定义和选择1.1定义胶原蛋白酶(Collgaenolytciprotease)定义为在适当的pH和温度下，只切割活性胶原螺旋区或明胶而不作用于其他蛋白底物的酶类1.2酶的选择能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶；从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1.398、放线菌166等)；此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面：一是酶对胶原蛋白作用的强度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶原水解率，而酶的纯度直接影响酶的价格，纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚远。因此开发的产品如没有特殊要求，一般可以考虑选择用已完全工业化的酶。除此之2外，还必须考虑酶对胶原的作用位点，因为这直接影响最后水解产物分子量的分布，是决定能否得到目标产物的一个关键因素[12-13][9-10]。。细菌胶原酶可分泌到胞外，通过发酵可大量获得，微[11]生物来源的胶原酶在应用方面具有更广的应用范围。2胶原蛋白酶的水解特性和作用机理的研究2.1胶原蛋白酶的水解特性对于水解胶原蛋白方面的研究，国外的报道很多。例如RuudA.Bank等采用SDS-PAGE决策法分别测定α-胰凝乳蛋白酶水解完整的胶原蛋白、热处理（70℃，30min）过的变性的胶原蛋白、以及用人体胶原酶解旋的胶原蛋白得到的碎片的尺寸，通过比较得出胰凝乳蛋白酶不能使完整的三股螺旋的胶原蛋白分子解链，但能使变性的胶原蛋白完全降解成小分子产物在37℃经过12h能够水解不能溶解的牛胶原蛋白[15][14]。。S.R.L.Teruel研究发现美洲比目鱼胶原蛋白酶不能水解牛胶原蛋白，鱼胶原蛋白酶在pH为7时活性最高。天然的鱼胶原蛋白酶。MasatoHiyama等人实验发现某种曲霉菌丝氨酸蛋白酶OK-22，在37℃，pH为7.5，经过48h，Ⅰ-型胶原蛋白的水解程度达到12％。曲霉菌丝氨酸蛋白酶水解Ⅰ-型胶原蛋白的上限大约是12％，与水解乳酪的程度一样，而真菌蛋白酶水解胶原蛋白的程度要比水解乳酪的程度弱的多[16]。SiripornDamrongsakkul等在用木瓜蛋白酶和应用Neutrase蛋白酶水解生牛皮时，发现应用Neutrase蛋白酶水解的产物中，胶原蛋白的水解产物的粘度跟水一样低。Ⅰ-型的人类胶原蛋白是存在于哺乳动物体内最丰富的一种分子，天然的胶原对大多数的胶原蛋白酶都具有抵抗力[17]。J.Friedrich等在研究角蛋白酶对天然胶原的水解能力时发现羽毛角蛋白和胶原不能被[18]这种从菌类提取的角蛋白酶水酶。曾名勇等采用正交试验确定了菠萝蛋白酶和alcalase2.4L碱性蛋白酶这两种酶单独水解鱼皮胶原蛋白的最佳酶解条件。在此基础上，进行复合酶水解实验，表明先采用菠萝蛋白酶水解，再用alcalase2.4L蛋白酶水解，效果更佳[19]。薛勇等在研究岩藻聚糖硫酸酯寡糖-Ce(Ⅳ)配合物的制备及其对胶原蛋[20]白的水解活性时发现小分子岩藻聚糖硫酸酯寡糖-Ce(Ⅳ)的配合效果最好，且水解胶原蛋白的活性高，并通过实验确定了配合条件以及配合物对胶原蛋白的最佳水解条件。孙爱梅等研究认为胰蛋白酶对天然胶原蛋白几乎没有作用，但可以降解变性的胶原蛋白。胰蛋白酶水解胶原的最适条件是pH为8.1～8.2、温度37℃。在此条件下，采用凝胶过滤色谱分析考察了酶用量时间对胶原蛋白降解过程的影响。通常情况下，在酶促反应中底物浓度比酶浓度高得多，增加酶用量对酶促反应初始速率影响较大，而且速率增加与酶用量成正比，随着底物浓度的降低，酶用量对反应速率的影响逐渐减小件为，并对胶原水解产物的理化性质进行了测定2.2胶原蛋白酶的作用机理对于酶作用机理的研究也很多。MisookKim等利用从生姜的根茎中提取的半胱氨酸蛋白酶GP2水解从小牛皮中提取的Ⅰ-型胶原蛋白时，发现这种酶能作用于胶原分子三条螺旋链上的相同位点，是目前唯一被证明能够水解天然胶原的植物半胱氨酸蛋白酶[23][22][21]。陈秀金等研究了用碱性蛋白酶水解脱铬革屑制备胶原水解产物时，影响胶原蛋白水解产物收获率的各种因素，确定了最佳水解条。。YoshioYamakawa等测定了纯出血蛇毒素水解几种白明胶和胶原蛋白的能力。但在天然胶原中只有Ⅳ-型胶原能够被水解。出血蛇毒素对Ⅳ-型胶原的水解具有时间依赖性，在开始的2h水解非常迅速；出血蛇毒素作用于Ⅳ-型胶原不同的位点来水解三股螺旋结构[24]。MagdaGioia等检测了嗜中性粒细胞胶原蛋白酶，白明胶酶A降解胶原纤维的作用机制，通过研究Ⅰ-型胶原蛋白在37℃时水解，确定了在3处理过程中两种α-链胶原蛋白的功能差异。运用热力学和动力学参数定量的比较，发现金属胶原蛋白酶对对胶原蛋白分子链的解旋和伸展至少有两种截然不同的机理[25]。A.CristinaSarmento等认为存在三种溶胶机理，一种是用裂缝胶原蛋白酶，[26]能够分裂稳定三股螺旋胶原蛋白，第二种是拓宽的精细蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶，能够作用于天然胶原蛋白分子的分裂的肽端，第三种是细菌蛋白酶及组织蛋白酶。EricDufour等研究了胶原酶和组织蛋白酶B水解Ⅲ-型的胶原时流体静压力的作用。实验证明高压条件下胶原分子表面一些氨基酸侧链不宜暴露，也不宜被组织蛋白酶B识别。胶原水解的速率随着压力的增大而减小。高压会导致酶和底物的构象发生变化，压力还会改变酶的弹性[27]。3影响酶活力的因素酶也是一种蛋白质，凡是能使蛋白质变性的因素，都可能使酶失去活性，如物理因素（温度、压力、光、磁场），化学因素（氧化、还原、溶剂、金属离子、离子强度、pH）和生物学因素（酶修饰和酶降解）蛋白酶在加工和贮存期间活力都会降低，在常温（25℃，湿度25%）下，贮存一个月酶活力降低达20％～30%，蛋白酶的易失活特性极大地限制了其生产和应用。蛋白酶的活性降低主要是由于蛋白酶的巯基易被氧化，与SO2的相互转化，形成了醌-硫醇复合物，并可自行降解。3.1化学因素3.1.1有机溶剂一般情况下，随着有机溶剂浓度的增大，蛋白酶活力呈直线下降。试验证明，当甲醇、乙醇、乙二醇浓度分别达到25.5%、20.5%、24.0%时，酶活力丧失一半，浓度达到50%时，酶活力完全丧失。在十二烷基硫酸钠（SDS）变性中，菠萝蛋白酶活力随SDS浓度的增大而呈指数下降，而α-螺旋度开始有所下降，然后出现回升趋势，SDS达4mg/ml时，酶完全失活，而α-螺旋度增加24%[28-30]。潘江球等研究报道，聚丙烯酰胺（PAAM）可使蛋白酶在30、45、50、60℃下贮存后，酶活力保留率分别提高l3.8%、22.9%、25.2%、28.4%。贮存温度越高，PAAM提高酶活力保留率的效果越明显，PAAM在液体酶中同样可以显著地提高酶的稳定性。这是因为PAAM是一种高分子亲核试剂，通过氢键固定在酶的表面来稳定酶分子构象；它对蛋白酶分子还起到一种包埋作用，有效地防止巯基的氧化失活；也由于它从酶相互作用区域排除水，降低自由能，使酶的贮存稳定性得到了显著的提高3.1.2金属离子在pH7.0时，草酸钠对蛋白酶有明显稳定作用，100mmol/L草酸钠能使酶活半衰期延长6倍，丁二酸钠、酒石酸甲钠对酶活也有一定的保护作用。醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠对蛋白酶都有一定程度的保护作用，并且浓度变化对保护作用的影响不大。研究证明，添加苯甲酸钠，贮存1个月后酶活力比对照组提高14％。添加焦亚硫酸钠，在15℃下避光保存2个月酶活力保持不变。Ca2+和Zn2+对蛋白酶有一定程度的保护作用。KCl和NaCl对蛋白酶热稳定性基本没有影响[32][31]。；CaCl2和MgCl2在一定浓度下显现出一定的保护作用，分别比对照品提高了21%和12.4%。Zn（Ac)2和ZnCl2在低浓度下就可增进酶的热稳定性，在合适的浓度下，酶活力分别比对照品提高了32.4%和29.1%。在这些金属离子中，发现对蛋白酶有一定作用的都是二价离子，以锌离子的作用较为明显，钙、镁离子次之。而对于锌离子，醋酸锌的功效显得更大些，它能以极低的浓度（5×10-4mol/L）获得显著的稳定效果。3.1.3共溶剂糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物如聚乙二醇（PEG）等一般被称为蛋白质的共溶剂。对某一活性酶来说，其酶失活半衰期是常数，因此可以菠萝蛋白酶失活半衰期用作衡量酶热稳定性的指标。研究证明，40％半乳糖对菠萝蛋白酶有一定的保护作用，能使其酶活半衰期提高3倍；50％葡萄糖可将菠萝蛋白酶的半衰期延长10倍，但4有研究指出，葡聚糖和肌醇对该蛋白酶没有保护作用。蔗糖、麦芽糖、棉子糖和松三糖等寡糖对菠萝蛋白酶均有明显的保护作用。也有人证明，低浓度的蔗糖、葡萄糖、β-环糊精、黄原胶对提高酶的热稳定性没有作用。5