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中低pH值下脯氨酸与葡萄糖Maillard反应产物抗氧化性研究*刘志华1,,祝元元1,2,董路3,王昆淼1,陈永宽1,缪明明1#（1.云南省烟草化学重点实验室，云南烟草科学研究院，云南昆明650106）(2.云南大学化学与工程学院,云南昆明650031)(3.成都军区昆明总医院药学部,云南昆明650032)摘要:以脯氨酸与葡萄糖的Maillard反应为模型，研究了两种加热方式下，三种配比反应混合物在两种pH值环境下，反应温度和时间对反应产物的抗氧化性影响。实验通过比色法来检测Maillard反应产物对DPPH自由基的清除率，用以表征其抗氧化性。结果显示：pH=5和7时，反应产物中都有抗氧化物质形成，较高的pH值和和葡萄糖配比更有利于反应产物中抗氧化物质的形成；微波加热时间对抗氧化物质形成影响不大，而常规油浴加热时间越长抗氧化物质形成越多；微波加热比常规油浴加热更能促进反应产物中抗氧化物质的快速形成。关键词：脯氨酸，葡萄糖，Maillard反应产物，抗氧化性，微波StudyonAntioxidantActivitiesoftheMaillardReactionProductsbetweenProlineandGlucoseunderlowerpHLIUZhi-hua1,ZHUYuan-yuan2,DONGLu3,WANGKun-miao1,CHENYong-kuan1,MIAOMing-ming1(1.KeyLabofTobaccoChemistryofYunnan,YunnanAcademyofTobaccoScience,Kunming650106,YunnanChina)(2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,YunnanUniversity,Kunming,650091,YunnanChina）(3.,DepartmentofPharmacy,KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Kunming,650032,YunnanChina)Abstract:TheantioxidantactivitiesoftheMaillardreactionproducts(MRPs)fromamodelreactionbetweenprolineandglucoseunderthreeratios,twopHof5and7,heatedwithoilbathormicrowave,werereportedinthispaper.TheantioxidationoftheMRPswascharacterwiththeclearancerateofDPPHdeterminatebyaUV-visible*云南中烟工业公司科技项目2010JC04，云南省创新团队建设项目2009CI014资助。刘志华(1974-)，男，云南勐腊人，副研究员。研究方向为卷烟产品减害降焦技术研发。#通讯联系人spectrophotometer.TheresultsshowedthattheantioxidantswereformedduringthereactionunderpHof5and7.ThehigherpHandcontentofglucosewouldbepreferablefortheformationofantioxidantswhenheatedwithmicrowaveoroilbath.TheheattimehaslittleeffectontheantioxidationofMRPswhenheatedbymicrowavewhilelongerheattimewouldbepreferableforthatheatedbyoilbath.Comparedtooilbath,themicrowavewouldshortthetimeofantioxidantsformationsignificantly.Keywords:Prolineandglucose;MaillardReactionProducts(MRPs);Antioxidation;MicrowaveMaillard反应是包括烟草在内的食品加工和储藏过程中一种重要的致香反应[1]，而Maillard反应产物(MaillardReactionProducts,MRPs)也可以作为有效的增香物质在低焦油卷烟上使用，以增强卷烟的香味[2]。研究表明，Maillard产物中的促黑激素释放素、还原酮、一些含N、S的杂环化合物还具有一定的抗氧化活性，某些物质的抗氧化活性甚至可以和合成抗氧化剂相媲美[3]。事实上，MRP具有抗氧化性早在1953年就被Hodge和Rist[4]首先报道了，而Frnazke和Ivainsky[5]也在1954年注意到了MRPs的抗氧化性，如今Maillard产物的抗氧化性已成为国内外研究的一个热点[3,6-14]。研究显示，Maillard反应产物的香气和颜色受到反应体系pH值、反应物料配比、反应时间和温度等的影响[15,16]。同样，Maillard反应产物的抗氧化性也受这些因素的影响，有关反应条件Maillard产物的抗氧化性的影响，报道较多[6-9,11-14]，但不同加热方式下反应条件对MRPs的报道不多。刘志华等[17]曾经报道了碱性条件下两种加热方式MRPs的抗氧化性，结果发现碱性条件下微波加热方式能更快促进反应达到目标。碱性环境有利于Maillard反应香气的形成，在制备反应性香料时应用较多[18]，但是研究显示，Maillard反应在中性或偏酸性条件下也能生成一些香味前体化合物[16,19]。为此，本文以烟草中含有的主要氨基酸脯氨酸作为氨基供应体，与提供羰基的葡萄糖发生Maillard反应为模型，系统对比常规加热条件和微波条件下，在pH为5和7时，反应物配比、反应时间等对MRPs的抗氧化性影响，以期为Maillard反应产物在烟草、食品等其他行业中新的应用提供参考。1、实验材料与方法1.1实验材料DL-脯氨酸（生化试剂，上海求德生物化工），无水葡萄糖（AR，广东汕头市西陇化工厂），DPPH（1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl，SIGMA），95%乙醇（AR，天津化工），蒸馏水，其它试剂为国产分析纯。1.2实验仪器UV-160A紫外-可见分光光度计（SHIMADZU，日本），78HW-1恒温加热磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司，中国），Φ200精密酸度计（BECKMAN，美国），BS210S分析天平（d=0.1mg,赛多利斯，德国），G8023CSL-K3家用微波炉（格兰仕，中国）。1.3实验方法1.3.1Maillard反应产物的制备称取脯氨酸5.75g（5.75g，5.75g），而后分别加入葡萄糖9.00g（4.50g，18.00g），使脯氨酸的氨基与葡萄糖的羰基的摩尔比为1:1，2:1，1:2，将其完全溶于蒸馏水中并定容至500ml。（１）分别取50ml反应液，用稀HCl溶液调节其pH值至5，在100oC下油浴加热2h，3h，4h，5h，6h；同时分别取50ml反应液（pH值7），同样加热条件和时间，然后分别测定其反应产物对DPPH的清除率。（２）分别取50ml反应液，用稀HCl溶液调节其pH值至5，置于消化管中，在火力为100的微波炉中加热1min，2min，3min，4min，5min后取出；分别取50ml反应液（pH值7），同样加热条件和时间，待溶液冷却至室温后分别测定其对DPPH的清除率。1.3.2Maillard反应产物抗氧化性的测定Maillard反应产物的抗氧化能力参考鲁伟等人[7,14]的方法，测定不同条件下的Maillard反应产物对DPPH的清除率。其测定方法如下：取Maillard反应产物（MRPs）0.5ml两份。一份加入0.5ml的DPPH溶液(DPPH溶液摩尔浓度为2×10-4mol/L)，另一份加入0.5ml95%的乙醇；再取0.5mlDPPH溶液，加入0.5ml95%的乙醇。三份反应液在常温下反应30分钟后，分别测定其在517nm处的吸光值。自由基的清除率可由下式得出：0ij0[A-(A-A]=100%[A]´清除率其中A0为乙醇溶液与DPPH溶液在517nm处的吸光值，Ai为MRPs与DPPH溶液在517nm处的吸光值，Aj为MRPs与乙醇溶液在517nm处的吸光值。2结果与讨论2.1pH=5时，不同加热条件下MRPs对DPPH的清除情况图1和图2分别是pH=5时，微波加热和常规油浴加热下，不同配比的葡萄糖（葡）和脯氨酸（脯）反应完成后的产物对DPPH清除率。比较图1和图2，微波加热3分钟左右，反应混合物的DPPH清除率就接近90%，而常规油浴加热5个小时DPPH清除率还不到60%，微波明显加快了反应进程[18]。在微波条件下，随着反应物配比中葡萄糖的增加，利于反应形成抗氧化物质，反应3分钟后就基本达到稳定；在常规油浴加热条件下，葡萄糖增加同样有利于抗氧化物质的生成，但相对较慢。0204060801000123456时间（分钟）DPPH清除率（%）葡：脯=1:1葡：脯=1:2葡：脯=2:1图1pH-5，微波加热方式下不同时间、不同配比下MRPs对DPPH的清除率01020304050600123456时间（h）DPPH清除率（%）葡：脯=1:1葡：脯=1:2葡：脯=2:1图2pH=5，常规油浴加热方式下不同时间、不同配比下MRPs对DPPH的清除率2.2pH=7时，不同加热条件下MRPs对DPPH的清除情况图3和图4分别是pH=7时，微波加热和常规油浴加热下，不同配比的葡萄糖（葡）和脯氨酸（脯）反应完成后的产物对DPPH清除率。比较图3和图4，微波加热2-4分钟左右，反应混合物的DPPH清除率就接近90%，而常规油浴加热5个小时DPPH清除率最高的才接近90%，再次证明微波明显加快了反应进程。在微波条件下，随着反应物配比中葡萄糖的增加，利于反应形成抗氧化物质，如图3所示，配比为1:1和2:1的混合物，反应3分钟后就基本达到稳定；在常规油浴加热条件下，葡萄糖增加同样有利于抗氧化物质的生成，但相对较慢。与pH=5时的反应相比，可以明显发现，pH值得升高对形成抗氧化物有利。如图3和图4所示，pH值升高后，同样是5h反应时间，pH=7时反应混合物的DPPH清除率就接近了90%。01020304050607080901000123456时间（分钟）DPPH清除率(%)葡：脯=1:1葡：脯=1:2葡：脯=2:1图3pH=7，微波加热方式下不同时间、不同配比下MRPs对DPPH的清除率01020304050607080901000123456时间（h）DPPH清除率（%）葡：脯=1:1葡：脯=1:2葡：脯=2:1图4pH=7，常规油浴加热方式下不同时间、不同配比下MRPs对DPPH的清除率2.3不同pH值反应条件下反应产物对DPPH的清除情况图5是葡萄糖和脯氨酸配比为2:1时，微波加热条件下pH值对反应混合物清除DPPH的影响，为便于比较，其中pH=9数据取自文献[18]，以下同。从图5可以发现，在微波条件下，pH值对反应形成抗氧化物质的影响不显著，这很可能是由于微波对反应的影响更大所致。0204060801001200123456时间（分钟）DPPH清除率（%）PH=9PH=7PH=5图5反应物配比=2:1，微波加热，pH值对反应产物清除DPPH影响图6是葡萄糖和脯氨酸配比=2:1时，常规由于条件下pH值对反应混合物清除DPPH的影响。结果显示，常规油浴加热方式下，pH值得影响显著，尤其是pH值=7时，反应在2h时，反应混合物的清除DPPH率就超过60%，同样反应时间下，反应混合物的清除DPPH率均远远超过了pH=7和5。01020304050607080900123456时间（h）DPPD清除率（%）PH=9PH=7PH=5图6反应物配比=2:1，常规油浴加热，pH值对反应产