第一章蛋白质结构与功能

1第一章蛋白质的结构与功能蛋白质译自albuminoid，该词来自拉丁文albumina（蛋白）。1838年，德国化学家Mulder建议采用protein一词，立即得到瑞典著名化学家Berzelius的支持，逐渐被学术界普遍采用，该词源自希腊文προτο，意为最原始、最基本、最重要的。可见，蛋白质自发现后一直受到化学家和生物学家的重视。因为蛋白质是活细胞中含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，是各种生物功能主要的体现者。蛋白质是以核酸为模板合成的，是基因表达的主要产物，因此人们将核酸称为“遗传大分子”，而把蛋白质称为“功能大分子”。近半个多世纪以来，以核酸-蛋白质的结构、功能及其相互关系为中心，逐渐形成了分子生物学，成为带领生命科学进入新时代的龙头。蛋白质是20种天然氨基酸缩合成的大分子，分子量从10kDa至数百kDa，有着极其复杂的结构。1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang提出蛋白质三级结构概念，把蛋白质研究纳入正轨。越来越多的证据雄辩地表明，蛋白质的功能与其特殊的结构有着十分密切的内在联系，结构是特定功能的内在依据，功能则是特定结构的外在表现。目前，对于蛋白质功能的认识包括以下三个方面：①蛋白质对生命活动的贡献，即其生物学意义；②蛋白质的分子功能，即它参与完成的生化活动；③蛋白质的亚细胞定位，即其发挥功能的位置与环境。以水通道蛋白（aquaporin）为例，它的四聚体定位于红细胞、肾细胞等的质膜中，形成一个通道，其功能就是允许水分子通过，为维持细胞内外渗透压平衡作出贡献。因此，阐明蛋白质的分子结构及其与功能的关系是现代生物化学的基本命题，是揭示生命运动规律的必由之路，应当受到所有生命科学工作者的关注。随着这些生物大分子及其复合物精确三维结构的测定以指数曲线增长，已累积了相当多的有关数据。在此基础之上，十多年来形成了以研究生物大分子及其复合物和组装体的三维结构、运动和相互作用，以及它们与生物学功能和病理现象的关系为主要内容的新兴学科——结构生物学，把生命科学推进到新的时代。1.1蛋白质的分子结构按结构特点天然蛋白质可划分为：球形蛋白质（globularprotein）、纤维状蛋白质（fibrousprotein）、膜蛋白（membraneprotein）和天然无序蛋白质（intrinsicallydisorderedprotein），其中，被研究得最早、最多和最深入的当属球形蛋白质。1952年，丹麦生物化学家Linderstrom-Lang把球形蛋白质的分子结构划分为三个不同的组织层次（level,hierarchy）：一级结构（primarystructure）指多肽链中氨基酸残基的数目、组成及其排列顺序（N-端→C-端），即由共价键维系的多肽链的一维（线性）结构，不涉及空间排列。二级结构（secondarystructure）是多肽链主链（backbone）在氢键等次级键作用下折叠成的构象单元或局部空间结构，未考虑侧链的构象和整个肽链的空间排布。三级结构（tertiarystructure）则指整个肽链的氨基酸残基侧链基团互相作用以及与环境间的相互作用下形成的三维结构。1958年英国晶体学家Bernal发现寡聚蛋白由具有三级结构的亚2基在次级键作用下结合而成，遂把寡聚体内亚基的空间排列称为四级结构（quaternarystructure）。上述蛋白质分子一、二、三、四级结构的概念已被国际生物化学与分子生物学学会命名委员会正式采纳和定义。1973年Rossman发现相邻的二级结构往往形成某种有规律的、空间上可辩认的、更高层次的折叠单元，称为超二级结构（super-secondarystructure）或折叠单元（foldingunit），主要涉及这些构象元件在空间上如何聚集。与此同时，Wetlaufer观察到蛋白质分子中存在相对稳定的球状亚结构，其间由单肽链相互连接，命名为结构域（structuraldomain）。图1.1和图1.2展示蛋白质（主要指球状蛋白）分子结构的不同层次及其相互联系。图1.1蛋白质分子的结构层次：A、一级结构，B、二级结构，C、结构域，D、三级结构，E、四级结构，F、大分子子组合体图1.2球状蛋白分子结构的不同水平图中A代表组成一级结构的各种氨基酸；S和sS分别代表蛋白质中的二级结构和由它们组合成的超二级结构；D/T表示蛋白质的结构域，如果是单结构域的蛋白质，此结构域即蛋白质的三级结构；同样，T/α表示由结构域构成的蛋白质的三级结构或亚基；Q代表蛋白质的四级结构，可以是n个相同亚基α装配成的同源聚集体，也可以是n个α亚基和m个β亚基（甚至更多种亚基）形成的异源聚集体。31.1.1蛋白质的一级结构1.1.1.1蛋白质氨基酸氨基酸是蛋白质的构件分子。在蛋白质生物合成中，mRNA指令20种α-氨基酸依次参入，形成特定的多肽链。这20种蛋白质氨基酸除Gly外，其α碳原子均属不对称碳原子，因而都具有光学活性，且均为L-型氨基酸。多肽链中氨基酸残基的侧链基团（R）各不相同，对多肽链的构象有很大影响。蛋白质氨基酸的一些重要参数可参看表1.1。表1.1蛋白质氨基酸的某些特性氨基酸缩写符号分子量（Da）体积（Å3）可接触面积（Å2）疏水性（K-D法相）总频率*（%）在内部的频率（%）在外部的频率（%）转移自由能(kcal·mol-1)Ala(A)71.0888.61151.8(7)8.711.07.90.20Arg(R)156.20173.4225－4.0(20)3.10.44.0－1.34Asn(N)114.11117.7160－3.5(15)5.22.06.3－0.69Asp(D)115.05111.1150－3.5(15)6.12.27.4－0.72Cys(C)103.13108.51352.5(5)2.75.41.80.67Gln(Q)128.14143.9180－3.5(15)3.61.34.5－0.74Glu(E)129.12138.4190－3.5(15)4.91.06.2－1.09Gly(G)57.0660.1750.4(8)9.09.78.80.06His(H)137.15153.2195－3.2(14)2.22.42.20.04Ile(I)113.17166.71754.5(1)4.910.53.00.74Leu(L)113.17166.71703.8(3)6.512.84.30.65Lys(K)128.18168.7200－3.9(19)6.70.38.9－2.00Met(M)131.21162.91851.9(6)1.53.00.90.71Phe(F)147.18189.92102.8(4)3.87.72.50.67Pro(P)97.12122.7145－1.6(13)4.02.24.7－0.44Ser(S)87.0889.0115－0.8(10)7.05.08.9－0.34Thr(T)101.11116.1140－0.7(9)6.44.67.1－0.26Trp(W)186.21227.8255－0.9(11)1.62.71.30.45Tyr(Y)163.18193.6230－1.3(12)4.43.34.8－0.22Val(V)99.14140.01554.2(2)6.612.74.60.61*46种蛋白质共5436个残基中各种氨基酸残基所占百分比为总频率；在分子内部每种残基总数被内部残基总数（1396）除所得百分比为在内部的频率；在分子表面每种残基总数除以表面残基总数（4040）得到的百分比为在表面的频率。根据侧链基团的性质，20种蛋白质氨基酸可划分为非极性氨基酸（Ile、Val、Leu、Phe、Ala、Pro、Met、Trp）和极性氨基酸，后者又可分为碱性氨基酸（Arg、Lys、His）、酸性氨基酸（Asp、Glu）和中性氨基酸（Gly、Cys、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln）。一般认为，如果发生同类氨基酸取代，不会对蛋白质的结构和性质产生明显影响。但是，如果这种取代发生在蛋白质的关键位点，尤其是许多同类氨基酸的翻译后修饰有很大区别，因而很可能出现突出的差异。例如，Lys的ε-氨基与Arg的胍基都带有正电荷，但前者4可被乙酰化、泛素化，后者可被ADPR基化；Tyr的苯环还可被碘化，羟基可被磷酸化，Phe则不能。对嗜热微生物的研究表明，它们的蛋白质中明显偏爱一些氨基酸，如碱性氨基酸中的Lys，酸性氨基酸中的Glu，非极性氨基酸中的Ile等。这种选择性很可能与嗜热菌蛋白质结构的稳定性和超强的耐热性相关。除上述20种蛋白质氨基酸外，近几年在含硒蛋白质中发现的硒代半胱氨酸（Selenocysteine）实际上是在蛋白质合成过程中特殊的Ser-tRNA的修饰产物，识别终止密码子UAG，参入多肽链，在这些含硒蛋白质中具有重要的功能。1.1.1.2蛋白质一级结构研究进展蛋白质的一级结构即多肽链中氨基酸残基的排列顺序（N-端→C-端）是由基因编码的，是蛋白质高级结构的基础，因此一级结构的测定成为十分重要的基础研究。1945—1955年，英国生物化学家Sanger率先完成了人胰岛素的序列测定。1950年，瑞典科学家Edman发明了以他的名字命名的N-端测定法，并与Begg在1967年发明了序列仪，极大地推动了蛋白质一级结构的测定工作。尽管如此，蛋白质一级结构测定仍是一项相当耗费时间和资金的工作。因而测序方法和技术的改进与创新势在必行。主要进展包括以下几方面：（1）Edman降解试剂和方法的改进Edman最初使用异硫氰酸苯酯，在许多方面已不能满足测定需要，因此要求进一步提高Edman降解试剂的专一性，并使降解产物（氨基酸衍生物）易于鉴定和提高检测灵敏度。如采用4-N，N-二甲基氨基偶氮苯-异硫氰酸酯/异硫氰酸苯酯双偶合法，可将测定精度提高1~2个数量级。同位素标记的降解试剂可用于10－12mol的肽测序。（2）序列仪的改进与创新早期的液相序列仪样品和试剂用量大，一次只能连续测定20~40个残基。1980年代中期以来，发展并改良的固相法采用PVDF膜，与待测蛋白的C-端偶联，样品用量减至1~10nmol，一次可连续测定60个残基。同时问世的气相测序仪灵敏度高，样品用量最少为5pmol，溶剂和试剂消耗为液相序列仪的10%，而且检测速度快。（3）质谱法在蛋白质测序中的应用质谱法特别适用于小肽测序，质谱/气相色谱联用仪自动化水平高，数秒钟即可完成10个氨基酸的小肽测序。由于把场致解吸附、等离子非吸附、离子喷射、快速电子冲击等技术引入质谱法，可省去测序中最耗时的分肽程序。（4）核酸测序与蛋白质测序有机结合，相互印证，仍是当前的最佳选择。据截止1997年底的统计，主要的蛋白质序列数据库SWISS-PROT已收入69000个蛋白的序列，其中绝大数是根据cDNA或DNA序列推测的。51.1.2蛋白质的二级结构1.1.2.1决定蛋白质高级结构的因素（1）肽链的折叠模式取决于其特定的氨基酸序列1960年代，C.Anfinsen牛胰RNase变性/复性实验证实（图1.3），多肽链中氨基酸序列包含着决定其三维结构的信息，称为蛋白质卷曲密码（codeofproteinfolding）或立体化学密码(stereochemistrycode)，至今尚未完全破译。（2）细胞内特有的微环境（pH、离子强度、水、温度等）是多肽链折叠成天然构象的重要环境因素。（3）维持蛋白质三维结构的作用力：蛋白质的三维构象主要靠二硫键和一些弱的相互作用或非共价键（次级键）来维持，包括氢键、盐键、疏水作用和VanderWaals力等，它们的键能见表1.2。表1.2蛋白质中的二硫键和几种次级键的键能键键能a(kJ·mol－1)二硫键210盐键12~30氢键13~30疏水作用12~20bVanderWaals力4~8a.键能指断裂该键所需的自由能。b.此数值表示25℃下非极性侧链从蛋白质内部转移到水介质中所需的自由能。此数值在一定温度范围内随温度升高而增加。实际上它并不是键能，此能量的大部分并不用于肽链伸展过程中键的断