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第五章微生物的生长繁殖与生长因子掌握研究微生物生长的方法及生长曲线在废水微生物处理中的应用；理解各种环境因素对微生物的影响；了解微生物之间的相互关系及菌种的保藏方法。一、微生物生长繁殖的概念二、研究微生物生长的方法三、细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用四、微生物生长量的测定方法第一节微生物的生长繁殖一、微生物的生长繁殖的概念微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程，这是个体生长的定义。繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。世代时间：细菌两次细胞分裂之间的时间。在世代时间期间，细胞内发生的变化有：染色体DNA的复制与分离；细胞质的增长与细胞结构的复制；细胞壁的扩增等。影响微生物的世代时间的因素包括：遗传性以及培养条件（如营养成分、pH、温度、水分和氧气等）。细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制：染色体DNA的复制和分离细胞壁扩增细菌的分裂无菌技术用固体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养单细胞(单孢子)分离选择培养分离二元培养物微生物的分离和纯培养微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptictechnique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。无菌技术试管、玻璃烧瓶、平皿(culturedish，petridish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质称为培养基(culturemedium)，可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。微生物培养的常用器具及其灭菌消毒、灭菌的基本概念消毒(disinfection)：杀灭物体上病原微生物的方法，但不一定杀死细菌芽胞。灭菌(sterilization)：杀灭物体上包括芽胞在内的所有病原性和非病原性微生物的方法。防腐(antisepsis)：防止或抑制细菌生长繁殖，细菌一般不死亡。抑菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。无菌(asepsis)：不含活菌的意思。防止微生物进入机体或物体的操作方法，称为无菌操作或无菌技术。进行微生物实验、外科手术及医疗技术操作等过程，均需进行严格的无菌操作。消毒灭菌的方法物理消毒灭菌法化学消毒法热力灭菌法辐射杀菌法滤过除菌法超声波杀菌法干燥与低温抑菌法同一温度下,湿热比干热效果好1.热力灭菌法热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两大类。在同一温下，后者效力比前者为大，这是因为：（1）湿热中细菌菌体蛋白较易凝固；（2）湿热的穿透力比干热大；（3）湿热的蒸汽有潜热存在。水由气态变为液态时释放出的潜热，可迅速提高被灭菌物体的温度。干热灭菌法焚烧：是一种彻底的灭菌方法，但仅适用于废弃物品或尸体等。烧灼：直接用火焰灭菌，适用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。干烤：用烤箱灭菌。一般加热至160℃～170℃经2小时。适用于高温下不变质、不蒸发的物品，如玻璃器皿、瓷器等。红外线：红外线辐射是一种0.77～1000微米波长的电磁波,有较好的热效应,尤以1～10微米波长的热效应最强。红外线由红外线灯泡产生,不需要经空气传导，所以加热速度快，但热效应只能在照射到的表面产生，因此不能使一个物体的前后左右均匀加热。红外线多用于医疗器材灭菌。湿热灭菌法煮沸法巴氏消毒法（pasteurization）用较低温度杀灭液体中的病原菌或特定微生物，而仍保持物品中所需的不耐热成分不被破坏的消毒方法。（62℃下30min或72℃下30min）流动蒸汽消毒法间歇灭菌法（fractionalsterilization）高压蒸汽灭菌法此法适用于耐高温和不怕潮湿物品的灭菌。（121℃,15个大气压,20分钟）2.紫外线与射线灭菌法紫外线：紫外线的杀菌作用与其波长有关。240～280nm时具有杀菌作用，其中以260nm最强。紫外线杀菌机理:同一条DNA链上相邻的胸腺嘧啶共价结合而形成嘧啶二聚体，因而改变DNA的分子构型，干扰细菌DNA的复制与转录，导致细菌的死亡或变异。紫外线穿透力差，只适用于空气及不耐热物品的表面消毒。电离辐射：微波、高速电子、X射线和γ射线等在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。其机制在于产生游离基，破坏细菌DNA。电离辐射常用于大量一次性医用塑料制品的消毒。3.滤过除菌滤过除菌是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，以达到无菌的目的。所用的器具是滤菌器（filter）。滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、细菌毒素、抗生素，以及空气等的除菌。滤菌器的种类很多，目前常用的有滤膜滤菌器、石棉滤菌器（亦称Seitz滤菌器）、玻璃滤菌器等。4.超声波杀菌法是一种机械的作用因素，每秒超过2万次振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器能产生20-100千赫的声波。可使细菌细胞壁裂解而死亡。5.干燥低温抑菌法干燥法低温法：低温可使细菌的新陈代谢减慢，常用作保存细菌菌种。冷冻真空干燥法是目前保存菌种的最好方法。（二）化学消毒法用化学药品进行消毒的方法，由于化学药品对细菌及人体都有毒性，故只能用于体表、医疗器械及周围环境等的消毒。杀菌机制：（1）使菌体蛋白质变性或凝固；（2）干扰细菌的酶系统和代谢；（3）影响细菌胞浆膜的通透性。消毒剂的主要种类类别作用机制常用种类酚类蛋白变性，细胞膜损伤石炭酸醇类蛋白变性乙醇氧化剂氧化、蛋白沉淀高锰酸钾、过氧乙酸、碘酒重金属盐氧化、蛋白酶变性红汞、硫柳汞表面活性剂蛋白变性，细胞膜损伤新洁而灭染料干扰氧化、抑制繁殖龙胆紫酸碱类破坏膜、壁，蛋白凝固醋酸、生石灰烷化剂蛋白质、核酸烷基化环氧乙烷影响消毒灭菌效果的因素1.消毒剂的性质、浓度和作用时间：一般情况下浓度越大，作用时间越长，杀菌效果越好。但70%的乙醇消毒效果好.2.微生物的种类与数量：同种消毒剂对不同微生物的杀菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力比其他的菌强；70%乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。3.环境中有机物的影响：消毒环境中如有有机物存在，如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀菌效果。4.温度、酸碱度等。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。接种操作AseptictechniqueStreakplatePourplateSpreadplate用固体培养基分离纯培养不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(cultureplate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。稀释倒平板法(pourplatemethod)涂布平板法(spreadplatemethod)平板划线分离法(streakplatemethod)稀释摇管法(dilutionshakeculturemethod)待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间，可能出现在平板表面或琼脂培养基中的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。稀释倒平板法Themethodofaserialdilutionsforviablecounting选择培养基分离法10102103104105106107dilutesample1ml9ml土豆培养基牛肉膏培养基高氏培养基在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。涂布平板法PourplatePourplatePourplatePourplate用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。平板划线分离法MixedculturePureculturePurecultureMixedcultureOralswabSwabfromsoleofshoeEachcolonywasexaminedmicroscopically光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行。将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后，冷却并保持在50℃左右，用这些试管进行梯度稀释待分离材料，试管均匀，冷凝，倾注一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间，挑取和移植单菌落。稀释摇管法二、研究微生物生长的方法（一）分批培养：将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、和溶解氧量，使微生物在其中生长繁殖。以细菌纯种培养为例,将少量细菌接种到新鲜、定量的液体培养基中进行分批培养，定时取样记数。以培养时间为横坐标，以细菌数目为纵坐标，连接各取样点坐标，会出现微生物数量由少到多，达到高峰后又由多到少的变化曲线。即细菌的生长曲线(growthcurve)。细菌的生长繁殖周期细菌的生长繁殖可分为4个时期：１．停滞期（迟滞期或适应期）：２．对数期（指数期）：３．静止期：４．衰亡期：停滞期(lagphase)出现原因：把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为0，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程。特点：生长速率常数等于零、菌体粗大、RNA含量增加代谢活力强、对不良条件抵抗能力降低。延滞期所维持时间的长短，因微生物种或菌株和培养条件的不同而异，实践已知延滞期可从几分钟到几小时、几天，甚至几个月不等；如大肠杆菌的延滞期就比分枝杆菌短得多。同一种或菌株，接种用的纯培养物所处的生长发育时期不同，延滞期的长短也不一样。缩短延滞期的意义和方法：接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄加大接种量用与培养菌种相同组成分的培养基指数期(对数期)(exponentialphase)活菌数和总菌数接近；酶系活跃，代谢旺盛；生长速率最大，ge